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1、医学微生物学实验内容提要一.内毒素（LPS）的检测二.肠道致病菌的分离培养三.细菌在自然界的分布及理化因素对细菌生长的影响（一）内毒素的检测目的1掌握内毒素实验的原理和操作方法。2熟悉内毒素实验的意义。检测内毒素的方法有家兔发热法和鲎（hòu）实验法，家兔发热法比较烦琐，且灵敏度不高，故现在多用鲎实验法，鲎实验法灵敏度高，可检测小于10ng/ml的内毒素。内毒素生物学活性：致热作用、白细胞反应、感染性休克和DIC等。原理：鲎是一种海洋节肢动物，其血液中含有一种有核变形细胞，这种细胞的胞浆中含有凝固
2、酶原和凝固蛋白原。内毒素（LPS）激活凝固蛋白原凝固蛋白（溶解状态）（凝胶状态）凝固酶原凝固酶材料：鲎试剂内毒素试剂鲎试剂专用溶解水无菌无热源质吸管方法：（每4个人一组，两支鲎试剂，一支实验一支对照）1.取两支鲎试剂打开，分别加入0.1ml鲎试剂溶解水，使之溶解2.其中一支加入0.1ml内毒素，标记上实验组，另一支加入0.1ml溶解水，作为对照3.垂直放入37℃温箱，20--30分钟观察结果结果：实验组出现凝固，对照组不出现凝固内毒素检测的应用：（1）检测输液用品或生物制品中是否含有内毒素（2）临
3、床上检测患者是否有革兰氏阴性菌感染引起的内毒素血症（内毒素休克）等二.肠道致病菌的分离培养2学时一.常见培养基的特性及用途二.致病性肠道杆菌的生物学性状三.分离培养方法肠道细菌的分离培养一、培养基概念:是人工配制的专供微生物生长繁殖的混合营养物制品。成分：充足的营养物质（水分、碳源、氮源、无机盐）；合适的PH，适宜的温度；适宜的气体环境。用途：用于微生物的繁殖及分离接种，传代或保存，鉴别微生的类属，研究微生物的生理及生化特性，制造菌苗、疫苗或其他微生物制剂等。二、分类主要用于增菌用于检测动力及保存
4、菌种用于分离鉴定细菌双糖铁培养基S-S培养基普通琼脂培养基血液琼脂培养基庖肉培养基培养基的制备程序调配过滤矫正pH（7.0-7.6）分装过滤灭菌（121.3℃，20-30分钟）鉴定是否有菌放入冰箱冷藏备用因高压之后pH值会下降0.1左右，所以矫正pH时应比所需的pH高鉴定是否有菌可将培养基置于37℃培养24小时，然后观察肉汤培养基制作方法1.将已去筋膜及脂肪并经绞碎的鲜牛肉50克，加蒸馏水100ml，放入冰箱中过夜。2.加热煮沸半小时至一小时后，用数层纱布或滤纸过滤，滤液用蒸馏水补足其量为100m
5、l。3.于滤液中加入氯化钠0.5克，蛋白胨1克，磷酸氢二钾0.1克，加热使之完全溶化。4.测定酸碱度并调至pH7.6，必要时用滤纸过滤。5.按需要分装于试管或烧瓶内，加棉塞，置高压蒸汽灭菌器内，经121.3℃、20-30分钟灭菌。6.灭菌后置37℃温箱孵育24小时，无杂菌生长，即可应用或放冰箱备用。液体培养基加入1-2%的琼脂为固体培养基，加入0.5%琼脂为半固体培养基。固体培养基加入血液即为血平板（营养培养基）。血液琼脂培养基（血平板）在普通琼脂培养基的基础上加入血液制备而成,是最常用的营养培养
6、基,可供营养要求较高的细菌生长.常用于分离培养和溶血现象观察.含有胆酸盐抑制G+,枸橼酸钠和煌绿能抑制大肠杆菌,致病的沙门菌和志贺菌能大量生长.含有中性红指示剂和乳糖,中性红遇酸变粉红.常用于培养肠道致病菌.SS培养基（Salmonella-ShigellaMediun）SS培养基肠道杆菌的生物学性状埃希菌属：大肠埃希菌沙门菌属：伤寒沙门菌甲型、乙型副伤寒沙门菌志贺菌属：痢疾志贺菌肠杆菌科重要菌属及代表菌种1大肠杆菌:生物学性状:G-镜下为杆状，多数菌株有周鞭毛，菌毛，无芽孢，兼性厌氧营养要求不高
7、,可在普通琼脂培养基上生长，发酵葡萄糖等,产酸产气最适宜温度为37度,最适宜pH为7.4肠道杆菌的生物学性状菌落特点：圆形，凸起，灰白色，表面光滑，湿润，直径2-3mm肠产毒型大肠杆菌（轻度腹泻，肠毒素，定植因子）肠侵袭型大肠杆菌（与志贺菌相关，与菌痢相似里急后重，不产生肠毒素）肠致病型大肠杆菌（最早发现的引起腹泻的大肠杆菌，婴幼儿）肠出血型大肠杆菌（出血性结肠炎和溶血性尿毒综合征的病原体，轻度水泻伴剧烈腹痛血便，常见食品污染）肠集聚型大肠杆菌（婴儿和旅行者持续水样腹泻偶有血便，不侵袭细胞，在细胞
8、表面自动聚集，形成砖样排列）分类：（胃肠炎）（2）伤寒杆菌生物学特性:G-镜下为杆状,有菌毛，除个别外都有周鞭毛，一般无荚膜，均无芽孢。兼性厌氧，营养要求不高,不发酵乳糖或者蔗糖，对葡萄糖，麦芽糖，甘露糖发酵，产酸不产气，其他沙门菌产酸产气，可在普通琼脂培养基上生长最适宜温度为37度,最适宜pH为7.4菌落特点:圆形,凸起,无色，细小，半透明,表面光滑,湿润,直径2-3mm.1、相似的形态染色—从形态上无法区别中等大小的G-杆菌多有鞭毛、菌毛肠道杆菌的生物学性状2、活泼的生化反应肠
