洪俊-微量凯氏定氮实验

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1、总氮量的测定——微量凯氏定氮法一、目的与要求1、学习微量凯氏定氮法的原理。2、掌握微量凯氏定氮法的操作技术，包括标准硫酸铵含氮量的测定、米知样品的消化、蒸馏、滴定及其含氮量的计算等。二、实验原理天然奋机物(如蛋白质、核酸及氨基酸等)的含氮量常用凯氏定氮法来测定。当被测的天然含氮化合物与浓硫酸共热时，分解出氮、二氧化碳及水。氮转变的氨与硫酸化合生成硫酸铵。分解反应进行得很慢，可加入硫酸铜与及硫酸钾或硫酸钠促进之，其中硫酸铜为催化剂，硫酸钟或硫酸钠可提高消化液的沸点。氧化剂过氧化氢也能加速反应。消化完Y后，在凯氏定氮仪屮加入强碱碱化消化液，使硫酸铵分解，放出氨。用水蒸汽蒸馏法,将氮蒸入过量标

2、准尤机酸溶液中，然后用准碱溶液进行滴定,准确测定氨量，从仙折算出含氮量。以甘氨酸为例，该过程的化学反应如卜*:1.NH2-CH2-COOH+3H2S04^2C02+3S02+4H20+NH32.2NH3+H2S04->(NH4)2SO43.(NH4)2SO4+2NaOH->2H2O+Na2SO4+2NH3T测定时常用硼酸溶液收集氨，氨与溶液屮的氢离子结合，生成铵离子，使溶液中氢离了•浓度降低。然U再用强酸滴定，直至恢复溶液中原來氢离•了•浓度为止。所用的强酸的当量数即相当于被测样品中氨的当量数。木法适用的范闱为0.2-1.0毫克氮。相对误差应小于士2%。三、试剂和器材1、试剂(1)浓硫酸

3、(化学纯)(2)30%氢氧化钠(分析纯)溶液(3)2%硼酸溶液。(4)0.0106N标准盐酸溶液。(5)粉末硫酸钾-硫酸铜混合物(K2SO4:CuSO4.5H2O=3:l或80gK2SO4?20gCuSO4,5H2O及0.34g硒酸钠)粉末，充分研细混匀。(6)指示剂混合液：取50ml0.1%甲烯兰-无水乙醇溶液与200ml0.1%甲基红-无水乙醇溶液混合，贮于棕色瓶中备用。本指示剂在pH5.2时为紫红色，在pH5.4为暗蓝(或灰色)，在pH5.6为绿色变色点PI=5.4,所以指示剂的变色范围很窄pH5.2-pH5.6，极其灵敏。(7)硼酸-指示剂混合液(9)30%双铽水或者高氯酸2、器

4、材(1)凯氏烧瓶(3)消化架(5)滴管(7)凯氏定氮蒸馏装置(9)锥形瓶(50ml)3、测定样品：血淸、鸡蛋淸、(8)标准硫酸铵溶液(0.3mg/ml)(2)表而皿。(4)吸量管(lml、2ml)(6)量简(10ml)(8)微量滴定管(5ml,可读至0.02ml)(10)容量瓶牛奶或K他样品操作方法1、样品处理血清样品：取人血或(猪血)，放于离心管屮，于冰箱屮放置过夜，次H离心除去血凝块，上M黄色透明清液，即为血清。吸出lml血清，加到50ml容量瓶中，用蒸馏水稀释到刻度，混匀备用。溶液如显浑浊，加少量氯化钠，再混匀。固体样品：测定某一固体样品屮的含氮量，都是按100克该物质的的干重所含

5、的氮克数来表示(％)。因此在定氮前应先将固体样品中的水分除掉。操作时先将样品磨细，在已称景瓶屮称入一定景的样品，再置于105°C的烘箱内烘烤1小时。用坩埚钳将称量瓶放入干燥器内，待降至室温G称重。按上述操作，每烘干1小吋后重复称量一次，直至两次称量数值不变，即达到恒重为止。2、消化准备4个50ml的凯氏烧槪，并称号，向第1、2、3号烧杯内各加入2ml样品溶液，再加入3-5个玻璃珠，防止暴沸。注意，用吸量管直接将溶液(或用试管加入固体样品)加至烧瓶底部，切勿沾于瓶品及瓶颈上。向4号烧瓶加入2ml水，其它操作同样品管，作为空白对照。在每个烧瓶屮加入约200mg硫酸钾-硫酸铜混合物，再用移液管

6、加入浓硫酸3ml,混匀，将以上4个烧瓶放到消化架上，置于通风橱

7、Aj进行消化，先用小火焰加热煮沸，首先看到烧瓶A物质碳化变黑，并产生大量泡沫，此吋要特别注意，不能让黑色物质上升到烧瓶颈部，否则将严重地影响样品的测定结果。当混合物停止冒泡，蒸汽与二氧化硫也均匀地放出时,将火焰调节到使瓶内液体微微沸腾。假如在瓶颈上发现冇黑色颗粒，应小心地将烧瓶倾斜振摇，用消化液体将它冲洗卜*来，在消化中要时常转动烧瓶，使全部样品都侵泡在硫酸内，以便在微沸的硫酸含中不断消化，消化液在轻度迥流的状况下大约维持6〜8小吋（对于那些赖氨酸含量较高的蛋白质样品甚至需要12小吋）。待消化液变成褐色后，为了加速完成消化，

8、可将烧瓶取下，稍冷，将30%过氧化氢溶液1〜2滴，加到瓶底消化液屮，再继续消化，直到消化液由淡黄色变成清晰的淡蓝绿色，消化即告完成（固体样品约需7小时）。为了保证反应的彻底完成，再继续加热消化1小吋。消化完结，关闭电源，使烧瓶冷却室温。后定容至100毫升。3、蒸馏（1）仪器的洗涤仪器洗浄的标准:用硼酸-指示剂混合液于冷凝管HI接受蒸汽时，若1〜2min后溶液未变成鲜绿色，而W变成灰色或暗绿色，即可认为基木上米变色仪器已洗净o凯氏微量