Hela细胞转染实验报告.pdf

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1、Hela细胞的传代培养及生长周期观察HE染色观察高学敏生362013012322一、实验背景（一）关于Hela细胞Hela细胞是源自美国妇女HenriettaLacks的子宫颈癌细胞，取于1951年，属于增殖型表皮癌细胞。在体外培养条件下，经过筛选，目前实验使用的Hela细胞为无限细胞系，在适宜条件下可以无限分裂，不会衰退，可以连续传代。经过六十多年，Hela细胞已经被培养出多个细胞系，它几乎成为细胞生物学中的一种“模式生物”。似癌细胞的特征，其核型已非二倍体型，而是非整数倍体（aneuploid）。2013年Andr

2、ewAdey等人在Nature发表的研究表明，Hela细胞的基因组相当稳定，可将不同细胞系区分开的点突变和基因拷贝数改变相当少1，这是Hela细胞的一大特点。（二）原代培养、传代培养、衰退进行细胞体外培养前，最初需要从活体中获得细胞。从体内获得细胞进行的首次培养为原代培养。当原代培养细胞增殖达到一定密度后，需要做继代培养，被称为传代培养。细胞在体外培养过程中的群体生存状况与在完整机体内的生存与衰老死亡基本一致；本次所做的Hela细胞实验为Hela细胞传代实验，即将已长到相当密度的原培养皿中的Hela细胞转移至新培养皿中

3、培养。在原代培养期，细胞增殖能力弱，第一次传代后，部分细胞可以重新贴壁，此时细胞增殖能力增强；另外亦是为了获得更多的细胞，因此进行传代操作。培养的组织细胞在体外可以反复传代十几次左右，若传代十几次后细胞进入衰退阶段并死亡，则该细胞系称为有限细胞系；若在衰退阶段，部分细胞的遗传特性发生改变，可以无限传代，则该部分细胞将发展为无限细胞系。Hela细胞系即为无限细胞系，已历经六十多年的传代培养。（三）贴附型细胞与悬浮型细胞在体外培养时，根据细胞能否贴附于支持物上分为贴附型细胞和悬浮型细胞两类。大多数细胞系属于贴附型细胞，血液

4、中的白细胞和某些癌细胞属于悬浮型细胞。Hela细胞属于贴附型细胞，它需要贴附于支持物上才可能存活并增殖。（四）两次传代之间的细胞周期在两次传代之间，未更换培养基时，细胞经历一个生长周期。刚进行传代后，细胞处于潜伏期。潜伏期中细胞适应新环境，贴附型细胞重新贴壁，因此潜伏期又可细分为游离期与贴附期。潜伏期结束后细胞进入指数生长期，指数生长期中已贴壁的细胞快速进行有丝分裂，使得培养皿中细胞密度快速增加。有丝分裂前，Hela细胞圆化，似与周围贴壁的未进行分裂的细胞分离，在实验条件下，Hela细胞的细胞周期约为24小时。多数普通

5、细胞存在接触抑制现象，即当平皿中的细胞相互接触，密度达到100%时细胞将停止分裂。但是许多癌细胞不存在接触抑制现象，Hela细胞属于不存在接触抑制现象的细胞。指数生长期后，平皿中细胞密度可达100%，甚至存在数层Hela细胞，此后细胞生长进入平台期。平台期，Hela细胞不继续进行增殖，群体共同生存一段时间。若不更换培养基，细胞群体将进入衰退期。衰退期间，即将死亡或死亡细胞脱离上浮，仍然贴壁的细胞内颗粒增加，细胞状态渐差，贴壁细胞密度开始逐渐降低。本次实验中，在Hela细胞培养的近1周时间内，未曾更换培养基，由于代谢废物

6、在培养基中的积累、营养物质被消耗、细胞大量增殖等原因，培养皿中的Hela细胞将经历完整的一个生长周期。（五）细胞体外培养的培养基与培养条件、进行传代操作时使用的消化液细胞在体外培养时，需要提供与体内近似的环境。这些环境因素包括：基本营养物质、生长刺激因子、水、温度、pH条件、无菌的环境、湿度、光照、气体环境等。本次实验采用90%DMEM高糖培养基加上10%胎牛血清与各1%的青霉素与链霉素组成混合细胞培养液。DMEM培养基可供给细胞合适的营养物质及pH条件等，胎牛血清可供给细胞某些仍然未知的生长因子，两种抗生素可提供一定

7、的抑制其他微生物生长的作用，但并不能保证一定不会有其他微生物生长，因此进行操作时，注意无菌操作才是避免污染的核心。抗生素的作用效果随时间逐渐衰退，且抗生素对于细胞有一定毒性。将Hela细胞置于37℃，5%CO2培养箱中培养。一方面由于37℃为人体温度，适宜于从人体中分离出的Hela细胞的生长；另一方面5%的CO2可以维持培养液的pH，且降低氧分压，由于过高的氧含量可能对细胞产生毒害作用（虽然没有明确的实验在证实过高的氧含量对培养细胞可能产生毒害作用，但是我猜测可能与病人在吸氧时不能吸纯氧是相似道理，氧气含量过高导致氧中

8、毒。这可能的原因是过高的氧气含量将胞内物质氧化，还生成大量自由基，对细胞产生毒害。）。培养箱中为黑暗环境，由于光照可能分解培养基中的物质，从而产生可能对细胞有害的物质。如体内的细胞，体外培养的细胞之间亦存在细胞外基质。细胞外基质的主要成分为胶原纤维、弹性纤维等蛋白类物质及透明质酸等糖类物质。在进行传代时，需要将细胞外基质消化，才能