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时间:2018-10-16
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1、细胞转染与筛选方法总结细胞转染:对数期生长的U251细胞经含EDTA的0.25%胰酶消化后,细胞计数,接种于六孔板,每孔种植2×105个细胞,加2ml/孔完全培养基培养过夜,弃去培养基,PBS洗3次,加入2ml/孔OPTI-MEM培养基。将3μlFUGENEHD加入94μl空白OPTI-MEM培养基中,混匀,室温放置5min,加入PEGFP-N1或PEGFP-LRIG1质粒体2μg,混匀,室温放置10min,加入六孔板中。六小时后,将细胞培养基换成DMEM完全培养基。细胞筛选:转染后36h,荧光显微镜下观察细胞转染情况,48h后加入G418,其终浓度为1000μg/ml。放入细胞
2、培养箱继续培养,每两天换液,重新加入G418。待正常组细胞全部死亡(约15d)将G418浓度调整至500μg/ml,继续培养2周后,长出抗性克隆,挑取单个克隆,在96孔板中扩增,培养2周后,单个克隆已经长满整个孔,将细胞消化后转入6孔板,使用完全培养基继续培养,继而进行其他指标的检测。细胞转染操作方法转染,是将外源性基因导入细胞内的一种专门技术。随着基因与蛋白功能研究的深入,转染目前已成为实验室工作中经常涉及的基本方法。转染大致可分为物理介导、化学介导和生物介导三类途径。电穿孔法、显微注射和基因枪属于通过物理方法将基因导入细胞的范例;化学介导方法很多,如经典的磷酸钙共沉淀法、脂质
3、体转染方法、和多种阳离子物质介导的技术;生物介导方法,有较为原始的原生质体转染,和现在比较多见的各种病毒介导的转染技术。理想细胞转染方法,应该具有转染效率高、细胞毒性小等优点。病毒介导的转染技术,是目前转染效率最高的方法,同时具有细胞毒性很低的优势。但是,病毒转染方法的准备程序复杂,常常对细胞类型有很强的选择性,在一般实验室中很难普及。其它物理和化学介导的转染方法,则各有其特点。需要指出的一点,无论采用哪种转染技术,要获得最优的转染结果,可能都需要对转染条件进行优化。影响转染效率的因素很多,从细胞类型、细胞培养条件和细胞生长状态,到转染方法的操作细节,都需要考虑。一、细胞传代1.
4、试验准备:200ul/1mlTip头各一盒(以上物品均需高压灭菌),酒精棉球,废液缸,试管架,微量移液器,记号笔,培养皿,离心管。2.弃掉培养皿中的培养基,用1ml的PBS溶液洗涤两次。3.用Tip头加入1mlTrypsin液,消化1分钟(37℃,5%CO2)。用手轻拍培养瓶壁,观察到细胞完全从壁上脱落下来为止。4.加入1ml的含血清培养基终止反应。5.用Tip头多次吹吸,使细胞完全分散开。6.将培养液装入离心管中,1000rpm离心5min。7.用培养液重悬细胞,细胞计数后选择0.8X106个细胞加入一个35mm培养皿。8.将合适体积完全培养液加入离心管中,混匀细胞后轻轻加入培
5、养皿中,使其均匀分布。9.将培养皿转入CO2培养箱中培养,第二天转染。二、细胞转染1.转染试剂的准备①将400ul去核酸酶水加入管中,震荡10秒钟,溶解脂状物。②震荡后将试剂放在-20摄氏度保存,使用前还需震荡。2.选择合适的混合比例(1:1-1:2/脂质体体积:DNA质量)来转染细胞。在一个转染管中加入合适体积的无血清培养基。加入合适质量的MyoD或者EGFP的DNA,震荡后在加入合适体积的转染试剂,再次震荡。3.将混合液在室温放置10―15分钟。4.吸去培养板中的培养基,用PBS或者无血清培养基清洗一次。5.加入混合液,将细胞放回培养箱中培养一个小时。6.到时后,根据细胞种类
6、决定是否移除混合液,之后加入完全培养基继续培养24-48小时。三、第二次细胞传代1.在转染后24小时,观察实验结果并记录绿色荧光蛋白表达情况。2.再次进行细胞传代,按照免疫染色合适的密度0.8X105个细胞/35mm培养皿将细胞重新转入培养皿中。3.在正常条件下培养24小时后按照染色要求条件固定。脂质体介导DNA转染法脂质体(lipofectinregeant,LR)试剂是阳离子脂质体N-[1-2,3-Dioleyoxy,Propyl]-n,n,n-TrimethylammoniumChloride(DOTMA)和Dioleoylphotidye-thanolamine(DOPE
7、)的混合物[1:1(w/w)]。它适用于把DNA转染入悬浮或贴壁培养细胞中,是目前条件下最方便的转染方法之一。转染率高,优于磷酸钙法,比它高5~100倍,能把DNA和RNA转染到各种细胞。用LR进行转染时,首先需优化转染条件,应找出该批LR对转染某一特定细胞适合的用量、作用时间等,对每批LR都要做:第一,先要固定一个DNA的量和DNA/LR混合物与细胞相互作用的时间,DNA可从1~5μg和孵育时间6小时开始,按这两个参数绘出相应LR需用量的曲线,再选用LR和DNA两者最佳的剂量,
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