组织工程人角膜内皮体外重建及其在兔角膜内皮移植中作用的研究

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1、组织工程兔角独创声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得!逵!麴遗查墓丝益蔓挂型壹塑的：奎拦互窒∑或其他教育机构的学位或证书使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：肛度签字日期：20IQ年1)月('日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，并同意以下事项：1、学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件

2、和磁盘，允许论文被查阅和借阅。2、学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同时授权清华大学“中国学术期刊(光盘版)电子杂志社”用于出版和编入CNKI《中国知识资源总库》，授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》。(保密的学位论文在解密后适用本授权书)学位论文作者签名：歹丛丧签字日期：2011)拥b日导师签签字日期：年月日组织工程人角膜内皮的体外重建及其在兔角膜内皮移植中的作用研究摘要完整的人角膜内皮层(humancornealendothelium，HCE

3、)是维持角膜正常厚度和透明度的关键，而角膜透明性是维持眼正常视功能的重要条件。成年后的人角膜内皮细胞(humancornealendothelialcell，HCEC)几乎没有增殖能力，局部细胞损伤后只能依靠邻近细胞扩张和移行来填补缺损区，一旦细胞密度低于维持角膜内皮生理功能之临界密度后就会引起不可逆病变，即角膜内皮盲。我国现有角膜内皮盲患者80余万人，全世界1100余万人，而且每年还在增加。角膜内皮盲患者绝大部分可以通过角膜移植而复明，但由于捐献角膜的数量非常有限，致使绝大部分患者因得不到移植角膜而无法复明。近年来，角膜组织工程的兴起为组织工程人角膜内皮

4、(tissue—engineeredcornealendothelium，TE-HCE)的体外重建和患者通过临床角膜移植而重建光明带来了新的希望。为此，本文在进一步对HCEC细胞系分子鉴定的基础上，从该细胞系中筛选出核型正常的单克隆细胞株，建立去上皮层修饰羊膜(mdAM)载体支架的制备与修饰技术，进而以HCEC单克隆细胞株为种子细胞、以mdAM为载体支架，对TE—HCE的体外重建及其动物移植作用进行了研究，旨在建立TE-HCE体外规模化重建的技术工艺条件，获得可长期维持兔角膜透明的TE—HCE，为角膜内皮盲的临床治疗和患者重见光明创造条件。为了进一步鉴定本

5、研究室所建立的国际上唯一1个非转染、无致瘤性HCEC细胞系的属性与功能，本文利用Westernblot对HCEC的标志蛋白、利用免疫荧光对HCEC的细胞连接蛋白、利用实时荧光定量PCR对HCEC的功能蛋白进行了鉴定。Westernblot的鉴定结果显示，该细胞系对人IV型胶原(角膜中内皮细胞的特异性分泌物)和血管内皮生长因子受体一2(FLK—1)有阳性表达，而对人血管性假血友病因子(humanyonWillebrandFactor，vWF)和角蛋白(keratin)的表达为阴性，表明该细胞系的确具有HCEC细胞系的固有属性；对细胞连接蛋白的免疫荧光检测结果

6、显示，该细胞系具有紧密连接蛋白1(ZO-1)、N一钙粘蛋白(N-cadherin)、间隙连接蛋白一43(connecxin一43)和整联蛋白av／p5(integrinQv／B5)的阳性表达，表明该细胞系仍具有形成细胞间以及细胞与细胞外基质问细胞连接的潜能；对膜运输蛋白的实时荧光定量PCR检测结果显示，该细胞系具有水孔蛋白(AQP-1)、Na+／K+泵Ql肽链、电位依赖性阴离子通道蛋白(hVDAC2和hVDAC3)、氯离子通道蛋白(hCLCN2和hCLcN3)、Na+／HCO,一协同运输蛋白(hSLC4A4)和囊性纤维化跨膜转运调控蛋白(CFTR)的阳性表

7、达，表明该细胞系仍具有发挥HCEC正常水孔蛋白通道、离子通道和泵的跨膜运输潜能。为了获得可用于TE-HCE体外重建的核型正常的HCEC种子细胞，本文利用20％胎牛血清(FBS)一DMEM／F12培养液，在37。C、5％CO：培养条件下，采用有限稀释法对所建立的HCEC细胞系进行了克隆化实验。对所获得的13个细胞单克隆进行染色体分析的结果显示，有7个单克隆细胞株的染色体数目为46条，并具有正常的二倍体核型。取其中一个单克隆细胞株C3B进行扩增培养，以用作TE-HCE体外重建的种子细胞。为了获得可用于TE—HCE体外重建的理想载体支架，本文又利用胰蛋白酶倒置消

8、化和信号分子包被法对新鲜羊膜进行了去上皮层处理与修饰。对所得mdA