甲基化的检测方法与临床应用

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1、甲基化的检测方法与临床应用麻守君张茂林杨志甫(内蒙古包头医学院·ti头医学院第一附属医院内蒙古也头014010)【中图分类号】R446【文献标识码】A【文章编号】1672-5085(2012)4-0433-02【摘要】DNA甲基化是表观遗传修饰最基木的方式，在维持正常细胞功能、胚胎发育和肿瘤发生、动脉粥样硬化中起着重要的作用，是当前学术研究的重点和热点。随着研究的深入，各种各样的甲基化检测方法被开发出来同时在临床应用也初见端倪，甲基化的深入研究必将对人类健康产生深远的影响。【关键词】表观遗传DNA甲基化PCR检测重亚硫酸盐单亲遗传病肿瘤动脉粥样硬化老化DNA甲基化是一

2、种重要的遗传外修饰，是表观遗传学(epigenetics)的重要组成部分［1］。甲基化是指由DNA甲基转移酶介导,在胞嘧啶的第5位碳原子上加上一甲基基团，使之变成5-甲基胞嘧啶(5-mC)的化学修饰过程。它参与了动物胚胎发育、基因印迹、X染色体失活等过程，在基因表达的调控中具有重要作用。基因组正常甲基化模式改变与某些遗传病和肿瘤［2］以及动脉粥样硬化性［3】有着密切相关性。木文就目前常用的甲基化检测方法和临床应用予以综述。1基因甲基化的检测方法1.1高效液相色谱柱Kuo等首次报道高效液相色谱柱(HPLC),它能够定量测定基因组整体甲基化水平，其过程是：用酸或酶将DNA裂解为五类单核

3、苷酸(包括5-mC)。因五类核苷酸在极性溶液中的溶解度不同，在经过非极性的过滤柱时，出柱时间也不同，用波长260nm的紫外光测定流出液的吸收峰并定量。此法灵敏度高，是目前测定基因组DNA中5-mC总量最标准的方法，但不能了解甲基化的位置和状态信息且对DNA纯度要求较高。1.2特异性位点的DNA甲基化的检测1.2.1甲基化敏感性限制性内切酶-PCR/Southern法甲基化敏感性限制性内切酶(methylation-sensitiverestrictionendonucleaseMS-RE)-PCR/Southern方法利用甲基化敏感性限制性内切酶对甲基化区的不切割的特性，将DNA消

4、化为不同大小的片段后再进行分析。常用的酶有Hpall-MspI(识别序列CCGG｝其中Hpall和MspI均能识别CCGG序列，然而当序列中的胞嘧啶发生甲基化时,HpaII不切割，利用Hpall-MspI的这种属性处理DNA,随后进行Southern或PCR扩增分离产物，明确甲基化状态［4］。其优点是可同吋检测基因组内多个CpG位点，实验结果易解释，成本低廉。缺点是:①由于CG不仅仅限于CCGG序列中，因此非该序列中的CG将被忽略;②只冇检测与转录相关的关键性位点的甲基化状态吋，该检测方法的结果才有意义;③需要样本量大;④存在酶消化不完全引起的假阳性的问题;⑤不适用于混合样本。1.

5、2.2直接测序法直接测序是由Frommer等提出的研究DNA甲基化的方法。过程是:重亚硫酸盐使DNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变，用不含任何CpG位点的引物行PCR扩增。扩增后尿嘧啶全部转化成胸腺嘧啶，对PCR产物进行测序并且与未经处理的序列比较，根据缺失条带判断CpG位点是否发生甲基化。此方法是一种可靠性及精确度高的方法,能明确0的片段中每一个CpG位点的甲基化状态，但需要人量的克隆测序,操作过程繁琐II费用昂贵。1.2.3甲基化特异性的PCRHerman等［5］在重亚硫酸盐处理的基础上提出了甲基化特异性的PCR(methylation-sp

6、ecificPCR,MS-PCR),它将DNA先用重亚硫酸盐处理，随后行引物特异性的PCR。用针对甲基化DNA链的引物能扩增出片段则为甲基化;用针对非甲基化DNA链的引物能扩增出片段则为非甲基化,由此明确待测序列中CpG位点是否存在甲基化。这种方法的优点是:①避免了使用限制性内切酶及相关问题;②敏感性高河用于石蜡包埋样本［6］«缺点是:①引物设计要求高，可靠的MS-PCR引物需设计包含2个或多个完全甲基化或非甲基化CpG位点，由此限制了MS-PCR的使用;②这种方法只能作定性研究，不能作定量检测;③存在重亚硫酸盐处理不完全导致的假阳性。1.2.4MethylightEads等［7】

7、报道Methylight是一种基于Taqman探针的甲基化特异性定量PCR技术。与MS-PCR不同的是加入了Taqman探针,探针的5*端连接报告荧光，3′端连接淬火荧光。如果探针能够与DNA杂交，则在PCR用引物延伸至探针吋,TaqDNA聚合酶5′到3′端的外切酶活性会将探针序列5′端的报告荧光切下,3′端淬火荧光不再抑制51端报告荧光,报告荧光发光，测定报告荧光的强度即可得到该位点的甲基化情况及水平;高敏