富硒金针菇硒蛋白清除羟自由基的研究

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1、富硒金针菇硒蛋白清除羟自由基的研宄摘要探讨甲基紫-Fe2+-H2O2体系的实验条件，得到了最佳的测定方案：pH值=3.5，甲基紫浓度1.4X10-5mol/L,Fe2+浓度1.2X10-4mol/L，H2O2浓度0.12%。在最佳实验条件下，采用紫外可见分光光度法研宄了富羟自由基是氧化能力极强的自由基，能很容易地氧化各种有机物和无机物。它可以与活细胞中任何分子（包括糖类、有机酸、核苷等）发生反应造成损害［1］。为了降低这种损伤，可选择一些抗氧化效果的食品食用，或者使用抗氧化剂［2］。硒是一种微量元素，对人体的正常代谢是不可缺少的。它可以有效地对体内的自由基起到清除效果，又可以起

2、到抗衰老的作用［3-5］o硒能与包括多糖、蛋白、核酸等在内的物质结合，形成含硒多糖、含硒蛋白、含硒核酸等，构成了生物体内主要的含砸生物大分子物质［6］。笔者利用甲基紫-Fe2+-H2O2体系研宄了富硒金针菇中硒蛋白对羟自由基的清除作用。1材料与方法1.1仪器与试剂HZQ-Q全温震荡器；冷冻离心机；7500c型ICP-MS；Cary50紫外一可见分光光度计；考马斯亮蓝G250;硫酸铵；甲基紫溶液(2X10-3mol/L);过氧化氢溶液(0.12%);Fe2+溶液(1X10-3mol/L)；缓冲溶液Tris-HCl:pH值3.5〜7.5。1.2试验方法1.2.1富硒金针菇硒蛋白的制

3、备。称富硒金针菇干样l.Og，加20mL二次水，在全温振荡器搅拌提取2.0h，抽滤至干。重复1次，合并滤液。根据结合溶液的体积准确量取一定体积的硫酸铵，要一边搅拌，一边慢慢向烧杯内部加入，直到硫酸铵的饱和度达到95%,经过透析后，进行硒含量C硒以及蛋白浓度C蛋白的测定，方法分别选择ICP-MS法和考马斯亮蓝染色法。1.2.2疑自由基的测定。在比色管(10mL)中分别加入浓度为2X10-4mol/L的甲基紫溶液1.4mL、浓度为0.1mol/L的pH值为3.5的Tris-HCl0.1mL、浓度为1X10-3mol/L的Fe2+溶液1.2mL，浓度为0.12%的H2O2溶液1mL,

4、最终体积定容到10.0mL,不足部分用离子水补足，并混合均匀。放置30min后，在波长578nm处测定吸光度，计算其与空白参比？驻Ao空白将Fe2+溶液和H2O2换成H2O即可。1.2.3富硒金针菇硒蛋白对羟自由基的清除率计算。在1.2.2体系中，加入一定量的硒蛋白提取物，低浓度组、中浓度组、高浓度组分别加硒蛋白1.0、3.0、5.0mL，充分混合均匀后再加入H2O2，静置30min后再对溶液的吸光度进行测定，计算出硒蛋白清除率S,公式如下：S（%）=[（A样品-A空白）/（A对照-A空白）]X100（1）2结果与分析2.1试验条件的优化2.1.1吸收光谱。分别测定了甲基紫溶液

5、（MV）、MV-Fe2+溶液、MV-H2O2溶液和MV-Fe2+-H2O2溶液的吸收光谱，发现前三者的最大吸收波长均在582nm附近且吸光度值几乎不变，而MV-Fe2+-H2O2溶液的最大吸收波长移到578nm，并且吸光度明显降低，说明体系吸光度值的下降是Fenton试剂产生的轻自由基与甲基紫作用的结果。2.1.2缓冲液的影响。考察了缓冲液pH值和用量对？驻A的影响。随着体系酸度的降低，？驻A降低，在pH值=3.5时体系？驻A最大，故选择体系的酸度为pH值=3.5。？驻A随着缓冲液用量的增加在降低，但在0.75、1.50mL之间变化非常缓慢。故本实验选用缓冲溶液体积为1.00m

6、L。2.1.3甲基紫用量的影响。缓冲溶液pH值为3.5,用量为l.OmL，加入不同体积的甲基紫溶液，随着甲基紫用量的增加，？驻A也在增加。当甲基紫溶液体积为3.5mL时，？驻A趋于稳定。所以本试验甲基紫用量为3.5mL。2.1.4Fe2+用量的影响。在缓冲溶液pH值为3.5,用量为1.0mL，甲基紫用量为3.5mL的条件下，考查Fe2+用量对？驻A的影响。随着Fe2+溶液用量的增加而增加，当Fe2+用量为3.0mL时，？驻A趋于稳定，故本实验Fe2+用量为3.0mL。2.2富硒金针菇硒蛋白清除羟自由基作用经考马斯亮蓝法和ICP-MS法测定，金针菇硒蛋白C硒为0.98Pg/g,C

7、蛋白为95.83Pg/mL。根据羟自由基工作原理，进行反应体系的设计，分别加入C蛋白空白蛋白1mL（低浓度组）、C硒Se的亚硒酸钠溶液3mL（中浓度组）、硒含量C硒的富硒金针菇硒蛋白5mL（高浓度组），保证硒和蛋白质的浓度保持在一个水平。中可以看出，加入亚硒酸钠、蛋白和硒蛋白后，与损伤图谱相比，A578都在增加，硒蛋白增加最大。随浓度增大，A578增加的幅度在加大。根据公式（1）计算清除率，具体中可以看出，与普通金针菇蛋白、亚硒酸钠相比，富硒金针菇蛋白清除羟自由基的效果更显著，因为富硒金针菇