缺血预处理对大鼠坐骨神经缺血再灌注损伤影响的实验研究

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1、●■所以本实验将着重于研究缺血预处理对周围神经缺血再灌注损伤是否具有保护作用，并探讨其最佳保护模式。●缺血预处理对大鼠坐骨神经缺血再灌注损伤影响的实验研究缺血预处理(IPc)指的是一种通过反复短暂缺血以延缓或减轻组织后续缺血再灌注(IR)损伤的现象。这种现象最早是由Murry等“3于1986年在犬心肌缺血模型中发现的，此后，预处理对心脏的保护作用已为大量实验资料所证实。Forrest等嘲于1992年首次将IPC应用于骨骼肌实验，发现IPC能提高骨骼肌的缺血耐受性，缩小骨骼肌坏死范围，而且预处理骨骼

2、肌的保护效果较心肌更佳。随后更多实验证实了IPC提高动物器官、组织缺血耐受现象的普遍性。近年来，IPC在骨科领域里的实验多集中于对肢体骨骼肌缺血再灌注损伤保护作用的研究，而对周围神经的IR损伤的影响则很少涉及。本实验采用暂时阻断sD大鼠髂总动脉血流的实验模型，观察IPC对大鼠后肢坐骨神经缺血再灌注损伤的影响，探讨缺血预处理对缺血再灌注损伤的保护作用是否亦存在于周围神经，并探索其最佳效应模式。材料与方法一．实验动物和分组选择雄性SD大鼠70只，体重200～3009，清洁二级。第一部份中先将40只大鼠

3、随机分为4组，分别为对照组、快速效应组、延迟效应组及叠加效应组各10只。第二部份中再将30只大鼠随机分为3组，每组10只，分别为一循环组、二循环组、三循环预处理组。实验动物购于复旦大学动物实验部。分组说明：1．对照组：缺血3小时，复流2小时。．10．●2．快速效应组：缺血lO分钟，复流lO分钟，缺血3小时，复流2小时。3．延迟效应组：缺血10分钟，复流10分钟，24小时后，缺血3小时，复流2小时。4．叠加效应组：缺血10分钟，复流10分钟，24小时后，缺血lO分钟，复流lO分钟，缺血3小时，复流2

4、小时。5．一循环，二循环，三循环预处理组：在第二部份中，以IPC最佳效应组为基础，进一步研究，于持续缺血前分别给予一循环，二循环，三循环预处理，每一次预处理循环均为缺血10分钟，复流10分钟。二．动物建模方法实验前禁食24小时，自由饮水，用0．5％戊巴比妥钠以30ral／kg行腹腔麻醉后，先剪开大鼠左侧腹股沟皮肤，钝性分离皮下组织以及肌肉层，暴露左髂外动脉后，逆动脉走行向上暴露左髂总动脉，用无损伤显微外科动脉夹阻断左髂总动脉血流。1，于各缺血组的相应分组时间取出动脉夹恢复血流。每次预处理均为缺血1

5、0分钟，复流10分钟。显微外科动脉夹20只购于上海金钟手术器械厂。●三．标本采集与检测指标1．血清酶的测定全部动物于复流2小时后行实验侧(左侧)股静脉穿刺抽血1．8ml，置于抗凝管内，血标本室温下静置2小时后，以3500r．rain-1离心5分钟，取血清，全自动生化分析仪测定乳酸脱氯酶(LDH)，谷草转氨酶(G0rr)，用硫代巴比妥酸法测丙二醛(姗A)浓度，用黄嘌呤氧化酶法测超氧化物歧化酶(SoD)活力。2．坐骨神经的免疫组化染色各组实验动物复流2小时后，在活体上取左侧坐骨神经标本，均取位于·左侧

6、膝关节上方2cm处同一位置，以快刀割断，标本放入中性福尔马林液中●固定，24小时后用无菌蒸馏水冲洗，再放入75％乙醇溶液中4。C保存。标本行石蜡包埋、切片，片厚5～6Um，连续切片，用免疫组化检测INOS，免疫组化步骤为：切片常规脱蜡入水，3％H：0：灭活内源性过氧化物酶，经抗原修复和正常血清封闭后，依次加入一抗、二抗工作液、酶杯链霉素一亲和素，DAB显色。以上iNOS一抗试剂盒购自晶美公司。免疫组织化学染色切片中以细胞胞浆或细胞膜呈现棕黄色或棕褐色为阳性，结合阳性细胞百分比及阳性细胞染色强度两个

7、方面评价。以“一”、“+”、“++”、“+++”来区分各组的免疫组化染色阳性程度，“一”为无阳性细胞，“+++”为强阳性。3．电生理每组实验动物中随机抽取2只sD大鼠在复流两小时时送复旦大学附属华山医院肌电图室对其左侧坐骨神经行电生理检测。测试仪器采用意大利Reporter肌电神经诱发电位仪，测试区域均选择位于血流阻断平面远端的坐骨神经，前路暴露后，取一长1．6cm的硅胶管置于坐骨神经外侧，术中刺激电极用不锈钢丝变成沟形，极间距离为3姗，长度15～20mm,极间电阻)lOOKo，于硅胶管远、近端的

8、坐骨神经各于一次电刺激；接受电极为同芯针电极，插于检测侧的腓肠肌，另用单极针接地。观察被检测段坐骨神经的潜伏期(1at)、波幅(amp)、传导速度(NCV)．以上检测用电极均由复旦大学附属华山医院肌电图室自制，检测工作均由同一医师操作完成。4．超微结构变化的观察每组实验动物中随机抽取1只sD大鼠在复流2小时后常规取材，取材位置位于左膝关节上方2cm处，取材后用2．5％戊二醛固定，纯树脂包埋，制成超薄切片，3％醋酸铀一枸橼酸铅双染色，用PhilipsCMl20透射电镜观察，放大倍数为