应用rhbmp-2颈椎前路椎间融合术后出现椎前水肿的实验研究

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1、青岛大学硕士学位论文等151研究发现应用rhBMP．2颈椎前路椎间融合术后出现椎前水肿可能与应用rhBMP．2的量有关。但是引起这种软组织水肿的确切机理目前还不清楚，因此本研究的目的在于应用动物实验，研究rhBMP．2在颈椎前路椎间融合术中引起软组织水肿的情况，并探讨其发生的机制。2材料和方法1．动物实验1．1实验动物和材料1．1．1实验动物成年雄性实验山羊，6．10个月龄，共12只，平均羊龄8．2个月；体重15—20kg，平均体重18．6kg。实验前观察山羊两周，确定山羊健康。12只山羊随机分为2组，6只为实验组，6只为对照组。1．1．2实

2、验器械手术刀、手术剪、高频电刀、颈椎拉勾、椎板咬骨钳、鹰嘴咬骨钳、及骨膜剥离器和自制的山羊颈椎前路钢板。1．1．3骨优导重组人骨形态发生蛋白2(rhBMP．2)为杭州远方生物科技有限公司生产的大肠杆菌的非糖基化肽，可以直接实验于动物的脊柱融合，不需要载体。1．1．4同种异体骨购买的羊髂骨，经上海远邦生物科技有限公司加工的消毒冻干骨。1．1．5其他，包括术中麻醉剂速眠新、青霉素钠(80万单位)、生理盐水等均为青岛大学医学院附属医院动物房提供。1．2术前检查、手术方法和术后处理．1．2．1术前检查术前前两天每天测量山羊进食后反刍开始时间、每小时反

3、刍次数、反刍持续时间和呼吸频率等与术后对比了解手术后对山羊进食和呼吸的影响。术前当天12只山羊均在速眠新lml肌肉注射麻醉后行颈椎CT(SomatomSensationCardiac64层螺旋CT机)检查，了解颈前软组织相应的情况并与术后进行对照。1．2．2手术方法山羊术前禁食、禁饮24h，肌注青霉素钠80万单位。速眠新1．5m1．2ml肌肉注射3青岛大学硕士学位论文麻醉后，平卧固定于手术台上。消毒铺巾，取右颈前外侧纵形切口，逐层切开皮肤、皮下组织，从气管、食管与颈动脉鞘之间分离进入，暴露颈长肌，山羊颈长肌较人粗厚、发达，覆盖整个颈椎椎体前面

4、。电刀切开颈长肌，骨膜剥离器剥离颈长肌，暴露颈椎椎体前面。继续向上或向下显露相邻一椎间隙，并清理椎体表面附着之肌肉，显露椎间盘组织，尖刀切开后使用刮匙切除髓核组织并刮除相应软骨终板，将同种异体骨用咬骨钳咬碎后添入椎间隙，实验组将骨优导lmg填入相应椎间隙，对照组填入PBS液。用钢板固定于相应手术椎间隙，连续缝合颈长肌，冲洗切口，逐层缝合，术中彻底止血，未安置引流。术后观察山羊至麻醉完全苏醒，颈部无需制动。1．2．3术后处理麻醉清醒后，观察山羊四肢活动情况。连续5d，每日2次肌肉注射青霉素钠80万单位，并检查伤口情况。术后密切观察山羊有无引水呛

5、咳、呼吸低浅和急促情况，及有无吞咽和反刍困难。并观察术后山羊开始进食时间、每天进食后反刍开始时间、反刍次数、反刍持续时间和呼吸频率。术后第5天将山羊在速眠新lml肌肉注射麻醉后行颈部CT检查，重点观察手术相应节段的同种异体骨有无脱落到椎管内，颈前软组织有无水肿，水肿范围，考虑到内固定造成的伪影，我们均选取的伪影下一层面进行比较，并采用ImageJN量CT图像上相应水肿节段的图像的水肿面积。实验动物进行CT检查结束后用将颈动脉放血的办法处死，切开手术处，观察局部软组织肿胀的形态，记录局部有无炎性积液。取手术相应节段的水肿最明显处标本，包括颈长肌

6、、食管和气管分别行HE染色和免疫组织化学。2．组织学实验2．1组织学材料2．1．1实验试剂Anti．BMP．2／4antibody(美国R&D公司)即用型SABC免疫组化染色试剂盒(武汉博士德公司)DAB显色试剂盒(福建迈新公司产品)其它化学试剂(福尔马林溶液等)为进口或国产分析纯试剂4材料和方法2．1．2实验仪器半自动组织包埋机(英国SHANDON公司)全自动真空脱水机(英国SHANDON公司)低温冰箱(青岛海尔公司)微波炉(1000VO(青岛海尔公司)可控式恒温干燥箱(山东潍坊医疗器械厂)石蜡切片机(Leica2655)各型号移液器(Gi

7、lson公司，法国)DP一10全自动显微照相系统(日本OLYMPUS公司)2．2组织学相关方法2．2．1石蜡包埋、切片1)颈前软组织置于409／L的多聚甲醛固定36h(固定液的体积应大于软组织体积的5倍)；2)颈前组织进行脱水、透明、浸蜡、包埋处理，过程如表1所示：表2．1脱水、透明、浸蜡、包埋时间表脱水透明浸蜡包埋液无丙体85％甲液75％95％水酮石苯体乙蜡液体名醇乙醇乙IIIIIIIII石蜡称III醇III醇III时3hlh2113hlmin间3)包埋好的石蜡块，放在冰箱里冷却2h，放在冰盒里，依次切片，切片厚红m。4)舡m厚的石蜡切片置

8、于60"C恒温箱烤片12h。5青岛大学硕士学位论文5)切片常规用二甲苯脱蜡，经各级乙醇至水洗：二甲苯(1)5min一--"甲苯(II)5min一100％乙醇2min