糖尿病早期大鼠视网膜神经细胞凋亡与caspase3表达的关系

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1、糖尿病早期大鼠视网膜神经细胞凋亡与caspase3表达的关系：李晓艳，张卯年，皮裕琍【摘要】　　目的:观察糖尿病早期大鼠，视网膜神经细胞凋亡与caspase3表达变化的关系。方法:健康雄性8周龄SD大鼠36只，建立糖尿病大鼠模型18只，正常对照18只。再各自分为4，8，12RNA表达情况。结果:正常对照组4，8，12RNA表达RQ值分别为1.6±0.6，1.5±0.5，1.6±0.3；糖尿病组4，8，12RNA表达RQ值分别为5.7±1.2，12.6±2.3，14.3±2.1；较同期对照组均明显升

2、高，差异有统计学意义（P<0.05）。结论:糖尿病早期视网膜神经细胞凋亡可能与capase3表达增强有关。【关键词】糖尿病；视网膜；神经细胞；凋亡；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶　　AbstractAIM:Toprobetherelationshipbetale8g/kg)toinducethediabeticmodel,andthentheyale8alcontrolgroup,andetimeediateddUTPnickendlabel(TUNEL)assay.Theproteinexp

3、ressionofcaspase3munohistochemistry.Caspase3mRNAlevelsinedbySYBRGreenRealtimePCRMasterMix.RESULTS:Thereatchedcontrolgroupsat8and12RNAlevelsRNAlevelsindiabeticratsthathaddiabetesfor4,8and12ayberelateda公司)；原位细胞凋亡（TUNEL）检测试剂盒、兔抗鼠半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase3)多

4、克隆抗体（武汉博士德生物技术有限公司）；SYBRGreenRealtimePCRMasterMix试剂:引物（北京奥科生物技术有限公司合成）：大鼠caspase3序列[3]（U49930）：5AATTCAAGGGACGGGTCATG3(上游)，5GCTTGTGCGCGTACAGTTTC3（下游）;大鼠βactin序列[4]（V01027）：5CCTGCTTGCTGATCCACA3(上游)，5CTGACCGAGCGTGGCTAC3（下游）。柱式动物RNA提取试剂盒（天

5、泽基因工程有限公司），逆转录试剂盒（Promega公司），RealMasterMix(SYBRGreen)（天根生化科技公司）。　　1.2方法　　STZ按60mg/kg一次性ip诱导糖尿病模型。模型建立标准：给药后48h剪尾法测血糖、尿糖试纸测尿糖，血糖>16.7mmol/L，尿糖+++以上者为糖尿病大鼠模型建立成功；给药后48h测血糖，均>16.7mmol/L，尿糖均在++以上。实验过程中，无血糖自行恢复者。每日饮水量、尿量明显多于同期对照组，随鼠龄增加体重初期改变不明显或略有增加，之后

6、呈逐渐下降趋势，最终呈现消瘦状态。100g/L水合氯醛麻醉大鼠，快速取出左眼眼球固定于40g/L多聚甲醛固定液中15～20min后，从角膜缘剪开眼球、小心去除眼前节和部分玻璃体，余下“眼杯”再次固定2h左右，依次梯度乙醇脱水、二甲苯透明后浸蜡包埋。连续4μm切片，切片位置选择在距视盘2mm处，用于caspase3免疫组织化学染色和TUNEL法凋亡细胞检测。　　1.2.1视网膜神经细胞凋亡的检测　　石蜡切片常规脱蜡至水化；30mL/LH2O2室温处理10min；ProteinaseK37℃消化10mi

7、n；取TdT和DIGdUTP各1μL,加入18μL标记缓冲液混匀后滴加至标本片，37℃湿盒内标记2h；加封闭液室温处理30min；用抗体稀释液1∶100稀释生物素化抗地高辛抗体，混匀后加至标本片，37℃湿盒内反应30min；用抗体稀释液1∶100稀释SABC，混匀后加至标本片，37℃湿盒内反应30min；DAB显色；Mayer苏木素轻度复染；水洗、脱水、透明、封片，显微镜观察。　　1.2.2caspase3表达的检测　　石蜡切片常规脱蜡至水化；30mL/LH2O2抑制内源性过氧化物酶；将切片浸入

8、0.01mol/L枸橼酸钠缓冲液（pH＝6.0）95℃水浴10min，自然冷却后滴加复合消化液修复抗原；滴加正常山羊封闭血清；滴加1∶300稀释的兔抗鼠caspase3多克隆抗体4℃过夜；生物素化山羊抗兔IgG37℃孵育30min；辣根酶标记链霉卵白素试剂37℃孵育15min；AEC显色剂室温下显色；Mayer苏木素衬染细胞核；水溶性封片剂封片，显微镜观察。另麻醉后的大鼠，迅速摘除右眼眼球，显微镜下剥离视网膜，标记分装至冻存管中置于80℃冰箱保存待测