mirna―181a及其靶基因共济失调―毛细血管扩张突变基因在胃癌组织中的表达及意义

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1、miRNA—181a及其靶基因共济失调一毛细血管扩张突变基因在胃癌组织中的表迖及意义［摘要］目的观察胃癌组织中微小RNA-181a(miR-181a)与其靶基因共济失调-毛细血管扩张突变基(ATM)的表达与异常情况，初步研究其意义。方法收集2009年4月〜2011年12月广州市第一人民医院外科手术切除的胃癌组织标本9例，同时选取其癌旁非癌组织标本作为对照，分析胃癌组织中iniR-181a与ATM蛋白表迗的相关性。提取其蛋白质及总RNA，采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测标本的miR-181a,Westernblot检测ATM蛋白。比较胃癌组织及癌旁非癌组织中m

2、iR-181a、ATM蛋白表达量。结果miR-181a在胃癌组织中的表达量为(1.981±1.800)，miR-181a在邻近非癌组织中的表达量为(0.394±0.093);灰度值检测：癌组织ATM蛋白为(0.2539±0.0046);非癌组织为(0.5525±0.0660)，癌及非癌组织中miR-181a、ATM蛋白表迗量比较，差异均有高度统计学意义(P象与方法1.1对象选取2009年4月1日〜2011年12月1日广州市第一人miRNA—181a及其靶基因共济失调一毛细血管扩张突变基因在胃癌组织中的表迖及意义［摘要］目的观察胃癌组织中微小RNA-181a(miR-18

3、1a)与其靶基因共济失调-毛细血管扩张突变基(ATM)的表达与异常情况，初步研究其意义。方法收集2009年4月〜2011年12月广州市第一人民医院外科手术切除的胃癌组织标本9例，同时选取其癌旁非癌组织标本作为对照，分析胃癌组织中iniR-181a与ATM蛋白表迗的相关性。提取其蛋白质及总RNA，采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测标本的miR-181a,Westernblot检测ATM蛋白。比较胃癌组织及癌旁非癌组织中miR-181a、ATM蛋白表达量。结果miR-181a在胃癌组织中的表达量为(1.981±1.800)，miR-181a在邻近非癌组织中的表达量

4、为(0.394±0.093);灰度值检测：癌组织ATM蛋白为(0.2539±0.0046);非癌组织为(0.5525±0.0660)，癌及非癌组织中miR-181a、ATM蛋白表迗量比较，差异均有高度统计学意义(P象与方法1.1对象选取2009年4月1日〜2011年12月1日广州市第一人民医院外科手术切除的胃癌标本9例，同时选取其癌旁非癌组织标本作为对照。通过病理专家确定所选胃癌标本均为中晚期胃癌，且入选患者术前均未行放、化疗等治疗。配对的癌旁非癌组织取其距胃癌癌灶边缘5cm以上，术后经液氮速冻保存在-80°C冰箱。本研究经广州市第一人民医院医学伦理委员会通过，所有患者

5、知情同意并签署知情同意书。1.2靶基因的预测运用3个生物信息学预测软件，预测miR-181a的靶基因。MiRanda、PicTar及TargetScan。1.3引物设计及合成在miRNABase数据库和GeneBank数据库中基因序列的查找，引物设计采用Primerexpress2.0软件。内参照U6及miR-181a由丹麦生物工程公司Exiqon设计、合成。1.4检测miR-181a采用实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）技术。用Trizol提取总RNA,95uLRNase-freeddH20加总RNA5uL（总RNA可稀释20倍），应用紫外分光光度计，选择RN

6、A为测定参数，稀释倍数设为20倍，调零校正用比色皿中加100uLRNase-freeddH2O,稀释后的总RNA在比色皿中实施定量检测，样本OD260/OD280的比值可同时检测。若OD260/0D280=1.9〜2.1则提示纯度很好；OD26O/OD2802.1提示有部分标本降解。总RNA完整性的检测：用凝胶成像系统观察总RNA的28、18s和5s3个条带，总RNA抽提较完整则3个条带完整。第一链互补DNA(cDNA)的合成:qRT-PCR采用MJResearch系列qRT-PCR仪，OpticonMonitor2为操作系统，按照miRNA逆转录试剂盒(EXIQON公

7、司)的操作说明，qRT-PCR试剂购自EXIQON公司(丹麦)，采用标准曲线法。根据反应体系中得到的Ct值，分别计算出9例胃癌组织和配对的癌旁非癌组织中的miRNAs的相对拷贝数(2-AACt)，相对值=癌组织的校正值/非癌组织的校正值，校正值=目的基因定量结果/内参U6定量结果。1.5ATM蛋白检测应用免疫印迹(Westernblot)方检测法ATM蛋白，具体方法：称取100mg组织标本，放置于高压灭菌后的研钵上，液氮研磨成组织匀浆，后加1mL蛋白提取液，经超声破碎5min,4°C，12000r/min离心10min，收集总蛋白。测定蛋