荧光探针技术测定细胞内离子浓度课件

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时间:2018-10-08

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1、荧光探针测定细胞内离子浓度技术陶亮中山医学院药理教研室细胞内离子cytoplasmNa+Cl-Ca2+K+Fe2+细胞内离子的生理功能细胞结构的组成成分血红蛋白中Fe2+、超氧化物歧化酶中Cu2+维持细胞膜电位K+、Cl-、Na+、Ca2+维持胞内外渗透压Na+协同转运葡萄糖等营养物质排泄代谢产物细胞内离子浓度异常与疾病细胞内Ca2+异常与疾病高血压骨质疏松癫痫细胞内Na+异常与疾病心律失常猝死细胞内K+异常与疾病惊厥阵发性舞蹈手足徐动症细胞内离子浓度测定意义预防疾病的发生提高疾病诊断的准确性增强治疗疗效常用细胞内离子浓度测定方法常用测定方法原子吸收光谱法——微量金属元素的测定:Na

2、+、K+、Ca2+化学滴定法——有机化合物与离子可产生颜色变化如:Ca2+可使铬黑T由蓝变红,使钙盐指示剂钙红从蓝变为酒红。放射性标记法——放射性标记目标离子,如[45Ca]微电极法荧光探针法其他新技术核磁共振法NMR不同脲素浓度下,通过监测1H,15N信号强度变化监控MMP-12折叠过程其他新技术生物芯片技术荧光强度反应荧光标记抗体与相应抗原结合程度LuisA.Rivas,et.al.A200-AntibodyMicroarrayBiochipforEnvironmentalMonitoring:SearchingforUniversalMicrobialBiomarkersthr

3、oughImmunoprofiling荧光探针荧光:某些物质吸收了与它本身特征频率相同的光量子后,其原子中的电子被激发到较高的能级,从而产生吸收光谱,有些物质,当用紫外线照射时,它吸收了某种波长的光后还会发射处各种颜色和不同强度的光,而当紫外线停止照射后,这种光也随之消失,这种光称之为荧光。分类:自发性荧光:组织在短波长光照射下自行发射出的荧光,如组织中蛋白质和酯类在紫外线照射下发出微弱的淡蓝色荧光;诱发荧光:组织与荧光色素结合后,经一定波长的光线照射后发出的荧光荧光探针:常用的诱发荧光,能产生荧光的生物染色剂称之为荧光染料或荧光探针荧光探针技术的应用pH测定GuoliangKe,e

4、t.al.ACell-Surface-AnchoredRatiometricFluorescentProbeforExtracellularpHSensingpH在6.0-8.0时,不同pH值,荧光探针具有不同荧光强度细胞间通讯GJIC检测标记活细胞线粒体线粒体荧光探针骨架蛋白MergeAbhikMallick,et.al.DualDrugConjugatedNanoparticleforSimultaneousTargetingofMitochondriaandNucleusinCancerCellsDNA标记通过X-Ray检测口服有机硅修饰PI荧光探针的口服吸收过程Michihi

5、roNakamura,et.al.Thiol-OrganosilicaParticlesInternallyFunctionalizedwithPropidiumIodideasaMulticolorFluorescenceandX‐rayComputedTomographyProbeandApplicationforNon-InvasiveFunctionalGastrointestinalTractImaging细胞膜电位检测JihoonKim,et.al.RapidCytotoxicityScreeningPlatformforAmyloidInhibitorsUsingaMe

6、mbrane-PotentialSensitiveFluorescentProbe细胞凋亡时,膜电位改变,膜结合荧光探针的强度反应细胞凋亡程度荧光探针技术测定过程荧光探针的负载荧光探针与目的离子结合荧光强度检测:荧光显微镜、流式细胞术、双波长荧光光度计荧光探针应用条件负载:探针必须局限于要测定离子浓度的区域,最常见的部位是细胞液,但有时为线粒体;校准:探针的荧光强度必须与游离离子浓度定量相关荧光探针的负载大量负载:AM酯负载酸负载ATP-诱导渗透阳离子脂质体递送电穿孔低渗休克单细胞负载——显微注射法膜片钳技术微量电泳法压力注射法荧光探针的负载—AM酯负载AM负载技术:Ca2+及其它阳

7、离子探针的羧基和PH探针的酚羟基被分别衍生为乙酰甲酯或乙酸酯,使探针可透过细胞膜并对离子不敏感,一旦进入细胞内,这些衍生的探针就可被普遍存在的细胞内酯酶水解,释放出离子敏感的多阴离子探针不足:区室化:细胞内膜包结构聚集AM酯不完全水解渗漏:有机离子载体、P糖蛋白多药载体等排除胞外荧光探针的负载—AM酯负载离解常数Kd:将荧光信号转化为离子信号的关键转换参数校准过程:记录对应于精确控制的离子浓度的荧光信号,通过换算计算出解离常数Kd,荧光探针的校准荧光探针技

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1、荧光探针测定细胞内离子浓度技术陶亮中山医学院药理教研室细胞内离子cytoplasmNa+Cl-Ca2+K+Fe2+细胞内离子的生理功能细胞结构的组成成分血红蛋白中Fe2+、超氧化物歧化酶中Cu2+维持细胞膜电位K+、Cl-、Na+、Ca2+维持胞内外渗透压Na+协同转运葡萄糖等营养物质排泄代谢产物细胞内离子浓度异常与疾病细胞内Ca2+异常与疾病高血压骨质疏松癫痫细胞内Na+异常与疾病心律失常猝死细胞内K+异常与疾病惊厥阵发性舞蹈手足徐动症细胞内离子浓度测定意义预防疾病的发生提高疾病诊断的准确性增强治疗疗效常用细胞内离子浓度测定方法常用测定方法原子吸收光谱法——微量金属元素的测定:Na

2、+、K+、Ca2+化学滴定法——有机化合物与离子可产生颜色变化如:Ca2+可使铬黑T由蓝变红,使钙盐指示剂钙红从蓝变为酒红。放射性标记法——放射性标记目标离子,如[45Ca]微电极法荧光探针法其他新技术核磁共振法NMR不同脲素浓度下,通过监测1H,15N信号强度变化监控MMP-12折叠过程其他新技术生物芯片技术荧光强度反应荧光标记抗体与相应抗原结合程度LuisA.Rivas,et.al.A200-AntibodyMicroarrayBiochipforEnvironmentalMonitoring:SearchingforUniversalMicrobialBiomarkersthr

3、oughImmunoprofiling荧光探针荧光:某些物质吸收了与它本身特征频率相同的光量子后,其原子中的电子被激发到较高的能级,从而产生吸收光谱,有些物质,当用紫外线照射时,它吸收了某种波长的光后还会发射处各种颜色和不同强度的光,而当紫外线停止照射后,这种光也随之消失,这种光称之为荧光。分类:自发性荧光:组织在短波长光照射下自行发射出的荧光,如组织中蛋白质和酯类在紫外线照射下发出微弱的淡蓝色荧光;诱发荧光:组织与荧光色素结合后,经一定波长的光线照射后发出的荧光荧光探针:常用的诱发荧光,能产生荧光的生物染色剂称之为荧光染料或荧光探针荧光探针技术的应用pH测定GuoliangKe,e

4、t.al.ACell-Surface-AnchoredRatiometricFluorescentProbeforExtracellularpHSensingpH在6.0-8.0时,不同pH值,荧光探针具有不同荧光强度细胞间通讯GJIC检测标记活细胞线粒体线粒体荧光探针骨架蛋白MergeAbhikMallick,et.al.DualDrugConjugatedNanoparticleforSimultaneousTargetingofMitochondriaandNucleusinCancerCellsDNA标记通过X-Ray检测口服有机硅修饰PI荧光探针的口服吸收过程Michihi

5、roNakamura,et.al.Thiol-OrganosilicaParticlesInternallyFunctionalizedwithPropidiumIodideasaMulticolorFluorescenceandX‐rayComputedTomographyProbeandApplicationforNon-InvasiveFunctionalGastrointestinalTractImaging细胞膜电位检测JihoonKim,et.al.RapidCytotoxicityScreeningPlatformforAmyloidInhibitorsUsingaMe

6、mbrane-PotentialSensitiveFluorescentProbe细胞凋亡时,膜电位改变,膜结合荧光探针的强度反应细胞凋亡程度荧光探针技术测定过程荧光探针的负载荧光探针与目的离子结合荧光强度检测:荧光显微镜、流式细胞术、双波长荧光光度计荧光探针应用条件负载:探针必须局限于要测定离子浓度的区域,最常见的部位是细胞液,但有时为线粒体;校准:探针的荧光强度必须与游离离子浓度定量相关荧光探针的负载大量负载:AM酯负载酸负载ATP-诱导渗透阳离子脂质体递送电穿孔低渗休克单细胞负载——显微注射法膜片钳技术微量电泳法压力注射法荧光探针的负载—AM酯负载AM负载技术:Ca2+及其它阳

7、离子探针的羧基和PH探针的酚羟基被分别衍生为乙酰甲酯或乙酸酯,使探针可透过细胞膜并对离子不敏感,一旦进入细胞内,这些衍生的探针就可被普遍存在的细胞内酯酶水解,释放出离子敏感的多阴离子探针不足:区室化:细胞内膜包结构聚集AM酯不完全水解渗漏:有机离子载体、P糖蛋白多药载体等排除胞外荧光探针的负载—AM酯负载离解常数Kd:将荧光信号转化为离子信号的关键转换参数校准过程:记录对应于精确控制的离子浓度的荧光信号,通过换算计算出解离常数Kd,荧光探针的校准荧光探针技

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