肾上腺髓质素和内皮素在糖尿病大鼠肾组织的表达

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1、肾上腺髓质素和内皮素在糖尿病大鼠肾组织的表达：高峰段惠军曹延萍王晓梅赵玉峰【摘要】目的探讨肾上腺髓质素(ADM)、内皮素-1(ET-1)及其受体在糖尿病肾病(DN)发病过程中的动态变化。方法单侧肾切除大鼠腹腔注射链脲佐菌素(STZ)诱发实验性糖尿病模型，大鼠随机分为对照组(A组)和糖尿病组(B组)，分别在注射STZ后第2、4和6周取材。采用免疫组化检测ADM、ET-1及其受体的表达，R)和内皮素受体A(EDNR-A)蛋白的表达，RT-PCR检测ADM和ET-1mRNA的表达。结果B组较A组ADM的表达先升高后降低，ADMR、ET-1和EDNR-A

2、表达增强。结论ADM和ET-1及其受体等血管活性物质在DN发病过程发挥着重要的作用。【关键词】糖尿病肾病;肾上腺髓质素;肾上腺髓质素受体;内皮素-1;内皮素受体A　糖尿病肾病(DN)是糖尿病患者的严重并发症之一，血流动力学改变在其中起着重要的作用。肾上腺髓质素(ADM)有明显的舒张血管、降低血压、利尿利钠、抑制细胞生长增殖等功能，在肾脏功能调节方面起着重要的保护作用。内皮素(ET)是一种具有强烈缩血管和促进细胞生长增殖作用的多肽，其中最重要是ET-1。他们都是重要的血管活性物质，在以往多　　研究其在血液中的变化，在肾组织中的研究甚少，通过研究AD

3、M和ET-1及其受体在糖尿病肾脏的表达情况，进一步探讨血管活性物质在DN中的作用机制。　　1材料与方法　　1.1动物模型的建立及分组选取120～150g雄性、肾上腺髓质素受体(ADMR)、ET-1和内皮素受体A(EDNR-A)多克隆抗体(武汉博士德生物工程公司);鼠抗β-actin单克隆抗体(北京中山公司);TaqDNA聚合酶(Promega公司)。　　1.3引物设计ET-1：正链5′CGTTGCTCCTGCTCCTCCTTGATGG3′，负链5′AAGATCCCAGCCAGCATGGAGAGCG3′，产物546bp;ADM：正链5′GGATCC

4、ATGAAGCTGGTTTCCATCGC3′，负链5′GAATTCCTATAACCTAGAGACTCTGG3′，产物570bp;GADPH：正链5′CTCTGCTCCTCCCTGTCC3′，负链5′GCCAGTAGACTCCACGACAT3′，产物363bp，引物由北京奥科生物工程公司设计合成。　　1.4生化指标测定用日立7170A全自动生化分析仪测定血血清葡萄糖(Glu)、尿素氮(BUN)、尿肌酐(Ucr)、血清肌酐(Scr)和尿蛋白，并计算肌酐清除率(Ccr)。　　1.5免疫组织化学检测用SP法，切片厚4μm，常规脱蜡至水，一抗为兔抗鼠ADM

5、、ADMR、ET-1或EDNR-A多克隆抗体(1∶100稀释)，二抗为生物素化羊抗兔IgG，DAB显色，苏木素复染，光镜观察，以细胞胞质着色呈棕黄色为阳性。　　1.6R和EDNR-A蛋白取肾皮质加入预冷的蛋白裂解液(2.5mmol/LEDTA，1%TritonX-100，10%甘油，1%脱氧胆酸钠，0.1%SDS，10mmol/L焦磷酸钠，50mmol/L矾酸钠，1mmol/L苯甲基磺酰氟)裂解，蛋白质定量采用Bradford法，10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜至PVDF膜上，用含5%脱脂奶粉37℃封闭2h，加适量一抗(1∶200)，4℃过

6、夜，洗膜后加适量辣根过氧化物酶标记的二抗，于37℃孵育2h，DAB显色，每组重复3次，以ADMR、EDNR-A与β-actin的光密度值分别表示其相对表达量，凝胶分析软件分析结果。　　1.7RT-PCR检测肾皮质ET-1和ADMmRNA的表达采用Trizol试剂提取RNA，用紫外分光光度计定量，反转录合成cDNA。PCR反应体系为25μl，在TaqDNA聚合酶催化下行PCR反应，扩增循环参数如下：94℃1min，57.5℃1min，72℃1min，32次循环后72℃延伸8min。PCR产物于1.5%琼脂糖凝胶电泳，紫外分析仪中观察并扫描。　　1.

7、8统计学处理所有数据均用x±s表示，数据比较用t检验，数据统计应用SPSS统计软件完成。　　2.4RT-PCR见图2。A组ADMmRNA表达较弱，B组各期表达较A组均明显增高，4RNA表达　　于4RNA在B组各周表达显著强于A组且有逐渐增加趋势，B组与A组相比数值分别为2RNA表达　　3讨论　　ADM和降钙素基因相关肽(CGRP)有27%的相关性，属于CGRP超家族。在以往，多检测糖尿病患者血浆和尿液ADM的变化，而在肾组织中研究极少〔1〕。我们通过建立实验性糖尿病模型，发现在糖尿病早期肾组织中ADM表达明显增高，且在蛋白和mRNA水平表达一致，

8、这可能与DN早期血流动力学改变有关，一些缩血管物质(如：AngⅡ、ET-1等)和尿蛋白的升高也可刺激ADM的生成和释放〔2〕。ADM可通