叶绿素测定(分光光度法)

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1、中华人民共和国行业标准叶绿素的测定（分光光度法）ＳＬ88—1994DeterminationofchlorophyII（Spectrophotometricmethod）水利部1995／05／01批准1995／05／01实施1总则1.1主题内容本标准规定了用分光光度法测定水体中的叶绿素。1.2适用范围本标准适用于河流、湖泊、水库或池塘等水体中叶绿素的测定。1.3干扰及消除1.3.1脱镁叶绿素ａ能够干扰叶绿素ａ的测定，当含有脱镁叶绿素时叶绿素ａ的测定值偏高。因此，在测定叶绿素ａ的时候，还要测定脱镁叶绿素ａ1.3.2脱镁叶绿素ａ对

2、叶绿素ａ的干扰，可通过测定叶绿素ａ酸化前后产生的吸收峰之比，对表观叶绿素ａ的浓度作脱镁叶绿素ａ的校正。2原理将一定量的试样用微孔滤膜过滤，收集植物性浮游生物，用90%的丙酮溶液提取。将提取液离心分离后，测定750、663、645、630ｎｍ的吸光度，计算叶绿素的浓度。3仪器3.1　分光光度计。3.2　比色池：10ｍｍ和50ｍｍ。3.3　医用离心机。3.4　离心管：10～15ｍＬ带塞刻度管。3.5　研钵：直径约80ｍｍ。3.6　过滤装置：过滤器，微孔滤膜（孔径0.45μｍ，直径60ｍｍ），真空泵（吸气泵或蠕动泵）。3.7常用实验

3、设备。4试剂4.1碳酸镁悬浮液：1%（ｍ／Ｖ）。称取1.0ｇ细粉末碳酸镁（ＭｇＣＯ3）悬浮于100ｍＬ蒸馏水中。每次使用时，要充分摇匀。4.2丙酮溶液：90%（ｖ／Ｖ）。在900ｍＬ丙酮中加100ｍＬ蒸馏水。4.3盐酸溶液：1ｍｏｌ／Ｌ。量取83ｍＬ盐酸（ρ＝1.19ｇ／ｍＬ）溶于水中，冷却并稀释至1000ｍＬ。5样品的采集与保存5.1样品应按浮游植物定量采样方法，采集在玻璃或聚乙烯瓶子里。河流、湖泊、水库取500ｍＬ，池塘取300ｍＬ。5.2采样后，样品应放在荫凉处，避免日光直射，最好立即对水样进行分析处理。如需放置水样，则

4、应避光冷藏保存（2～5℃），而且每升水样需加1ｍＬ1%碳酸镁悬浮液，以防止酸化引起色素溶解。6步骤6.1浓缩：在一定量的试样中添加0.2ｍＬ碳酸镁悬浮液，充分搅匀后，用直径60ｍｍ的微孔滤膜吸滤。过滤器内无水分后，还要继续抽吸几分钟。如果要延时提取，可把载有浓缩样品的滤膜放在干燥器里冷冻避光贮存。6.2提取：将载有浓缩样品的滤膜放入研钵中，加入3ｍＬ丙酮溶液（4.2）至滤纸浸湿的程度，把滤膜研碎，再少量地加90%的丙酮溶液，把滤膜完全研碎，然后用90%丙酮溶液将已磨碎的滤膜和丙酮溶液洗入带刻度的带塞离心管中，使离心管内提取液的

5、总体积不超过6ｍＬ，盖上管塞，置于4℃的暗处浸泡24ｈ。6.3离心：将离心管放入离心机中，以4000ｒ／ｍｉｎ速度离心分离20ｍｉｎ。将上清液移入标定过的10ｍＬ具塞刻度管中，加少量90%丙酮溶液于原提取液的离心管中，再次悬浮沉淀物并离心，合并上清液。此操作重复2～3次，直至沉淀不含色素为止，最后将上清液定容至10ｍＬ。6.4测定：取上清液于10ｍｍ或50ｍｍ的比色池中，以90%丙酮溶液为对照溶液，读取波长750，663，645和630ｎｍ的吸光度。选择比色池的光程长度或稀释度，使其光密度ＯＤ663大于0.2，小于1.0。7结

6、果表示从各波长的吸光度中减去波长750ｎｍ的吸光度，作为已校正过的吸光度Ｄ，按下式计算叶绿素的浓度：8注意事项8.1使用的玻璃器皿和比色皿均应清洁、干燥、无酸，不要用酸浸泡或洗涤。8.2750ｎｍ处的吸光度读数用来校正混浊度。由于在750ｎｍ的提取液的吸光度对丙酮与水之比的变化非常敏感，因此对于丙酮提取液的配制要严格遵守90份丙酮比10份水（体积比）的配比。8.3使用斜头离心机时，容易产生二次悬浮沉淀物。为了减少这一困难，使用外旋式离心机头，在离心之前瞬间加入过量的碳酸镁。8.4在研钵中用90%丙酮溶液提取叶绿素时，如果研磨操

7、作进行不充分，就不能完全提取出来。也可以用外筒玻璃代替研钵，研棒用特氟隆制的匀化器。8.5因为叶绿素提取液对光敏感，故提取操作等要尽量在微弱的光照下进行。8.6吸收池事先要用90%丙酮溶液进行池校正。8.7750ｎｍ的吸光度是检查90%的丙酮溶液浊度的。用10ｍｍ吸收池，750ｎｍ的吸光度在0.005以上时，应将溶液再一次充分地离心分离，然后再测定其吸光度。