pcr技术大攻略

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1、一、PCR技术及步骤聚合酶链式反应（PCR）PCR扩增产物的克隆 上述两个实验包含基本原理、步骤、问题等。二、PCR常见问题汇总 1. 没有得到扩增产物  （1）酶失活或在反应体系中未加入酶。TaqDNA聚合酶因保存或运输不当而失活，往往通过更换新酶或用另一来源的酶以获得满意的结果。  （2）模板含有杂质。特别是对甲醛固定及石蜡包埋的组织常含甲酸，造成DNA脱嘌呤而影响PCR的结果。  （3）变性温度是否准确：PCR仪指示温度与实际温度是否相符，过高酶在前几个循环就迅速失活；过低则模板变性不彻底。  （4）反应系统中

2、污染了蛋白酶及核酸酶，应在未加Taq酶以前，将反应体系95℃加热5-10分钟。  （5）引物变质失效。人工合成的引物是否正确。是否纯化，或因储存条件不当而失活。  （6）使用PCR试剂盒时还应注意：  ①是否严格按照说明书操作；  ②试剂使用前是否充分混匀；  ③试剂储存过久或不当而失效。  2. 扩增产物在凝胶中涂布或成片状  （1）酶量过高。减少酶量；酶的质量差，调换另一来源的酶。  （2）dNTP浓度过高。减少dNTP的浓度。  （3）MgCl2浓度过高。可适当降低其用量。  （4）循环次数过多；增加模板量减少

3、循环次数，缩短退火时间及延伸时间，或改用二种温度的PCR循环。  （5）退火温度过低。  （6）电泳体系有问题：  ①凝胶中缓冲液和电泳缓冲液浓度相差太大；  ②凝胶没有凝固好；  ③琼脂糖质量差。  （7）若为PCR试剂盒则可能：   ①由于运输储存不当引起试剂盒失效；  ②试剂盒本身质量有问题，如引物选择、循环参数等选择不当。  （8）降解的陈旧模板扩增也易产生涂布。  3. 溴酚蓝前有区带（很宽）  （1）模板量太低。增加模板DNA的用量。  （2）循环次数太多。减少循环次数。  （3）复性度偏低。提高复性温度

4、。  （4）预变性后没有立刻上机循环。  （5）引物3'端是否互补；重新设计合成较长的引物。  （6）引物用量偏多。降低引物的使用量。  4. 扩增产物出现多条带  （1）引物用量偏大，引物的特异性不高。应调换引物或降低引物的使用量。  （2）循环的次数过多。适当增加模板的量，减少循环次数。  （3）酶的用量偏高或酶的质量不好，应降低酶量或调换另一来源的酶。  （4）退火温度偏低，退火及延伸时间偏长。应提高退火温度，减少变性与延伸时间，也可采用二种温度的PCR扩增。  （5）样品处理不当。  （6）Mg2+浓度偏高，

5、因适当调整Mg2+使用浓度。  （7）若为PCR试剂盒，也可能时试剂盒本身质量有问题。5. PCR假阳性结果  （1）引物设计不当，应调换引物。  （2）循环参数不合适，导致非特异性扩增。  （3）靶序列的交叉污染。6. PCR假阴性结果  （1）引物长度不够。  （2）试剂浓度不标准。  （3）靶序列如突变、缺失等。  （4）循环参数设置错误。  （5）标本中有Taq酶抑制剂。  （6）PCR产物检测系统灵敏度不够。三、PCR经验总结 1. 增加PCR的特异性  （1）引物设计这是最重要的一步。理想的，只同目的序列

6、两侧的单一序列而非其他序列退火的引物要符合下面的一些条件： a 足够长，18-24bp，以保证特异性.当然不是说越长越好，太长的引物同样会降低特异性,并且降低产量；  b GC%40%~~~~60%；  c 5'端和中间序列要多GC，以增加稳定性；  d 避免3'端GC富集，最后3个BASE不要有GC，或者最后5个有3个不要是GC；  e 避免3'端的互补，否则容易造成二聚体。  f 避免3'端的错配；  g 避免内部形成二级结构；  h 附加序列(RTsite,Promotersequence)加到5'端,，在算T

7、m值时不需要加上这些序列，但在检测互补和二级结构是要加上它们；  i 需要使用兼并引物时，要参考密码子使用表,注意生物的偏好性，不要在3'端使用兼并引物，并使用较高的引物浓度(1uM-3uM)；  j 最好学会使用一种designsoftware.PP5,Oligo6,DNAstar,VectorNTI,Onlinedesginetal.*引物的另一个重要参数是熔解温度（Tm）。这是当50％的引物和互补序列表现为双链DNA分子时的温度.Tm对于设定PCR退火温度是必需的。在理想状态下，退火温度足够低，以保证引物同目的

8、序列有效退火，同时还要足够高，以减少非特异性结合。合理的退火温度从55℃到70℃。退火温度一般设定比引物的Tm低5℃。  设定Tm有几种公式。有的是来源于高盐溶液中的杂交，适用于小于18碱基的引物。有的是根据GC含量估算Tm。确定引物Tm最可信的方法是近邻分析法。这种方法从序列一级结构和相邻碱基的特性预测引物的杂交稳定性。大部分计算机程序使用近