荧光定量PCR完全攻略

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1、荧光定量PCR完全攻略荧光定量PCR完全攻略1、什么是定量PCR?以参照物为标准,对PCR终产物进行分析或对PCR过程进行监测,从而达到评估样本中靶基因的拷贝数,称为定量PCR.定量PCR的可行性定量一般是在PCR扩增的指数期进行的.2、定量PCR定量的理论依据是什么?特定的待扩增基因片段起始含量越大,则指数扩增过程越短,当扩增速率趋于稳定后,则无论原来样品中起始模板含量多少,最终扩增片段的含量通常是一样的.理想的扩增结果:Y=X*2n其中Y代表扩增产物量,X代表PCR反应体中的原始模板数n为扩增次数;理论上PCR扩增效

2、率为100%,PCR产物随着循环的进行成指数增长,但实际上:DNA的每一次复制都不完全,即每一次扩增中,模板不是呈2的倍增长;实际应为:Y=X(1+E)n,其中E代表扩增效率:E=参与复制的模板/总模板,通常E≤1,E在整个PCR扩增过程中不是固定不变的.通常X在1~105拷贝、循环次数n≤30时,E相对稳定,原始模板以相对固定的指数形式增加,适合定量分析,这也就是所谓的指数期;随着循环次数n的增加(>30次),E值逐渐减少,Y呈非固定的指数形式增加,最后进入平台期.3、荧光定量PCR定量的理论模式又是什么?PCR是对原

3、始待测模板核酸的一个扩增过程,任何干扰PCR指数扩增的因素都会影响扩增产物的量,使得PCR扩增终产物的数量与原始模板数量之间没有一个固定的比例关系,通过检测扩增终产物很难对原始模板进行准确定量.近年来研究人员通过大量的实践,研究了相对准确的定量PCR方法,即荧光定量PCR.PCR扩增通式:①Tn=T0(1+E)n②Tn=Tn-1(1+E)n注:[0

4、生一定的荧光(荧光依赖于某一循环扩增产物的总量,即特定的拷贝数K,为常数,大约在1010左右)高于背景为仪器所识别,此时的循环数为CP(crossingpoint),也就是K=T0(1+E)CP,取对数即:lgK=lgT0+CP*lg(1+E)CP=-1/lg(1+E)*lgT0+lgk/lg(1+E)由于对一特定的PCR而言,E与K均为常数,故上式为循环数(CP)对原始模板拷贝数的对热线电话:021-544608318009881995E-mail:master@shinegene.org.cn网址:www.synth

5、esisgene.com.cn1数(lgT0)一次方程,其标准形式y=kx+b,该直线的斜率为-1/lg(1+E),在横坐标上的截距为lgk/lg(1+E),也是荧光定量PCR所谓的标准曲线.例如下图为单管实时荧光定量RT-PCR的标准曲线:目前荧光定量PCR均采用外标定量外标法定量PCR扩增效率的计算,由于标准曲线的斜率(Slope)为-1/lg(1+E),可知E=10-1/Slope-1,如从标准曲线中知道Slope=-3.337,则可推知扩增效率E=101/3.337-1=0.99,也有作者将(1+E)直接视为扩增

6、效率E,则E=10-1/Slope,求得的E值均在1—2之间,有时也有大于2的结果,如下图所示.另外也可直接根据系列稀释外标在该次实时荧光PCR的结果来大略分析扩增效率的高低,例如系列10倍稀释外标在PCR扩增时有N2=N0En2,N3=(10*N0)En3,在扩增到指数期时荧光值相同则代表此点的终末拷贝数相同,即N2=N3,En2-n3=10,取对数得到⊿ngE=1,E=10l1/⊿n,E=2,⊿n=3.32;E=1.8,⊿n=3.91.反之亦然.如图所示.热线电话:021-544608318009881995E-ma

7、il:master@shinegene.org.cn网址:www.synthesisgene.com.cn24、定量PCR根据反应体系是否设有参照物以及是否与标本在同一管中进行扩增,定量PCR可分为四种方法:①有限稀释法,即倍比稀释法:通过稀释阳性样品直至靶基因不能再扩增为止,来设置已知浓度的参照品;根据阳性结果的最大稀释度及内参标或外参标的极限检出底线,计算出待检标本中原始模板的分子数;利用最大稀释度来进行标本核酸定量时的注意点A、PCR产物的最低可检测极限须有重复性;B、对每个稀释度必须作多次PCR,一般先对模板DN

8、A作10倍连续稀释后作PCR,首先找到PCR结果呈阴性的接近稀释点,然后再对各稀释度作系列的2倍稀释,每个稀释点作5次PCR;C、必须严格控制污染.优点:不需要特殊设备;缺点:扩增反应条件的标准化、严格注意污染,避免假阳性的产生.②使用外参照物的定量PCR,以已知浓度的目的基因为模板,按一定的倍比稀释,然后做出标准曲