阴离子交换色谱-脉冲安培检测法测定奶粉中羟脯氨酸

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1、阴离子交换色谱-脉冲安培检测法测定奶粉中羟脯氨酸摘要：介绍了阴离子交换色谱柱分离，脉冲安培法检测奶粉中羟脯氨酸的方法。奶粉样品经酸水解后可直接进样检测，脉冲安培检测器检测羟脯氨酸的检出限在0.04μmol/L，并具有较宽的线性范围（0.1-10μmol/L）。离子色谱-脉冲安培检测法测定奶粉中的羟脯氨酸，具有无需衍生、操作简便，灵敏度高等优点，可作为奶粉中违法掺加皮革水解蛋白与否的判断依据。关键词阴离子交换色谱，脉冲安培检测，奶粉，羟脯氨酸一、引言动物皮革水解蛋白是一种廉价蛋白原料，是将牛皮及其制品下脚料等粗加工后制成的水解蛋白质。由于该

2、蛋白产品中蛋白质含量可高达85%以上，且成本极为低廉，某些非法厂家为降低生产成本，在乳粉和其它乳制品中掺入廉价的水解动物蛋白来冒充或替代乳蛋白质[1,2]。国家卫生部于2009年2月公布的《食品中可能违法添加的非食用物质名单(第二批)》的通知中明确规定乳及乳制品、含乳饮料中禁止添加皮革水解蛋白。皮革的主体蛋白类型为胶原蛋白，而羟脯氨酸则是胶原蛋白中特有的氨基酸，约占胶原蛋白氨基酸总量的10%。而乳蛋白质则不含羟脯氨酸，因此常将羟脯氨酸含量作为奶粉及乳饮料产品掺假与否的证据。目前国内对羟脯氨酸的检测方法主要有分光光度法[3]、高效液相色谱法

3、[1]、氨基酸分析仪法[2]等。其中比色法虽然操作简便，但因为缺乏分离手段而容易导致假阳性。由于大部分氨基酸都不具备常见检测器的可检基团，因而液相色谱法、氨基酸分析仪都需要先经过衍生后方可被检测。离子色谱‐脉冲安培检测法[4]测定氨基酸是一种新型技术，其主要通过检测氨基在金电极表面反应电流变化，因而无需衍生，操作简便。文中介绍了离子色谱法用于测定奶粉中羟脯氨酸的方法，奶粉样品经酸水解后经离子色谱柱分离，脉冲安培检测器直接检测，对多种奶粉中羟脯氨酸的含量进行准确测定。二、实验部分2.1仪器和试剂ICS-3000型离子色谱仪（Dionex，美

4、国），带有Ag工作电极、pH/Ag/AgCl复合参比电极、Ti对电极的ED3000电化学检测器；Chromeleon6.80色谱工作站；Nanopure超纯水机(ThermoScientificBarnstead，美国)；0.22μm微孔尼龙膜（天津富集）2.2前处理方法平行称取奶粉样品两份50-100mg固体样品到安培瓶中，加入6mol/L盐酸溶液10mL，液氮冷冻后抽真空，在酒精喷灯上烧结瓶口，于110℃恒温干燥箱中水解22h。冷却后，混匀，开管，用移液管吸取200μL滤液，置浓缩仪中蒸发至干。加入2mL0.02mol/L盐酸和0.0

5、2g/L叠氮化钠混合溶液，摇匀后备用。测定前，取500μL该样品溶液，以0.02g/L叠氮化钠溶液稀释至10mL，摇匀后过滤后可直接进样分析。2.3测定条件分析柱：AminoPacPA10，250×2mm；保护柱：AminoPacPA10，50×2mm；ED3000脉冲安培检测，Au工作电极电极，PH/Ag/AgCl参比电极模式，氨基酸电位波形。淋洗液条件：AminoPacPA10使用说明中Table3“radientConditionsforAminoAcidsandCarbohydrates”，其中添加42.2-44.2min，0.1

6、mol/LHOAc冲洗步骤。流速：0.25mL/min；进样方式：自动进样，25μL；柱温：30℃。三、结果与讨论3.1标准曲线和方法检出限氨基酸在0.1-10μmol/L范围内具有良好的线性，线性相关系数（R2）为0.9999。根据三倍信噪比可计算出羟脯氨酸的方法检出限在0.04μmol/L，也即5μg/L，具有较高的灵敏度。图1.某奶粉样品水解后氨基酸分离谱图3.2样品测试分别对四种奶粉样品经酸水解后进行测定，发现这几种奶粉中确实存在羟脯氨酸，图1为经空白校正后的奶粉水解液的样品色谱图。但2#样品中的羟脯氨酸含量明显较低，考虑到掺假如

7、此低不存在太明显利益效果，怀疑是某奶粉营养添加剂引入了羟脯氨酸。而其余三个样品中存在的羟脯氨酸含量都在0.3%甚至1%左右，怀疑其存在掺假可能。表1.样品测定结果四、结论离子色谱-积分脉冲安培法检测奶粉中羟脯氨酸无需衍生即可直接进样分析，测试成本较低。且由于使用安培检测器因而具有较高的灵敏度，可检测到样品水解液中0.1μmol/L的羟脯氨酸，因而更加适用于奶粉及乳制品中皮革水解蛋白掺假的检测。参考文献[1].金苏英，林笑容，赵志红，等，饮料工业，2009，7：28‐30[2].曾暖茜王洪健周兴起冯志强，现代食品科技，2008，7：719‐

8、721[3].彭亚锋，周耀斌，薛峰，等，中国调味品，2010，2：100‐101[4].墨淑敏，梁立娜，蔡亚岐，等，分析试验室，2006，5：36‐39