热休克蛋白70减轻帕金森病细胞模型中α

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1、热休克蛋白70减轻帕金森病细胞模型中α【关键词】α-突触核蛋白;热休克蛋白70;过表达　α-突触核蛋白是一种在中枢神经系统突触前表达的可溶性蛋白,具有调节膜稳定性和神经可塑性等生理功能。近年研究发现，α-突触核蛋白基因过表达或突变可引起α-突触核蛋白的错误折叠、有毒蛋白寡聚体和多聚体的形成，使其结构和功能障碍，从而启动一系列级联反应致多巴胺能系统损伤，最终导致帕金森病(PD)。研究认为神经保护剂可能是治疗PD的一个新的有效途径，而热休克蛋白70(HSP70)就是其中之一。HSP70是分子伴侣家族中的一员,作为一种重要

2、的应激蛋白,能与　错误折叠的蛋白相互作用，阻止聚集物的形成;除此之外，HSP70还有助于错误折叠蛋白的降解〔1，2〕。在果蝇及酵母的PD模型中发现，HSP70能减轻α-突触核蛋白的毒性及其引起的神经细胞凋亡〔3，4〕,而HSP70抑制α-突触核蛋白毒性可能与其能够与α-突触核蛋白相互作用，阻止α-突触核蛋白纤维样聚集，降低α-突触核蛋白表达量有关〔5，6〕。为进一步证实HSP70在α-突触核蛋白所致PD的作用，本实验首次在神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)PD模型中检测了HSP70的作用及机制，发现HSP70可以通过

3、降低α-突触核蛋白水平发挥对PD细胞模型的保护作用。　　1材料与方法　　1.1实验材料SH-SY5Y细胞购自ATCC公司;限制性内切酶购自Takara公司;QIAprepTIP100Kit购自QIAGEN公司;人胎脑cDNA文库、胎牛血清(FBS)、Lipofectamine2000购自Invitrogen公司;蛋白酶抑制剂cocktail购自Sigma公司;anti-α-synuclein204抗体、anti-beta-actin抗体购自Santacruz公司;聚偏二氟乙烯(PVDF)膜购自Millipore公司。

4、　　1.2方法　　1.2.1质粒构建以人胎脑cDNA文库为模板，PCR获得α-突触核蛋白可编码序列(CDS序列)以NotⅠ和HindⅢ连接到pCDNA3.1真核表达载体中，通过overlapPCR方法，构建A53T突变体，同样以NotⅠ和HindⅢ连接到pCDNA3.1真核表达载体中。按照QlAprepTIP100KitProtocol抽取并纯化质粒，测序证实。pCDNA3.1-HSP70质粒由湘雅二医院肝移植中心李杰群博士惠赠。　　1.2.2细胞培养与转染SH-SY5Y细胞采用含10%FBS的高糖DMEM培养液，置

5、于37℃，5%CO2的培养箱培养。转染严格按照Lipofectamine2000说明书进行。用不含FBS的DMEM培养基洗涤细胞2次，24孔细胞培养板每孔加入含2μlLipofectamine2000及0.8μg质粒DNA、不含FBS的DMEM培养基500μl，在37℃，5%CO2的培养箱中孵育3h，改用含10%FBS的DMEM培养基继续孵育48h。　　1.2.3免疫荧光将稳定表达蛋白的SH-SY5Y细胞接种到有盖玻片的24孔板中，用含10%FBS的DMEM培养于37℃、5%CO2培养箱中36h后，弃去培养基，3.7

6、%的多聚甲醛/磷酸缓冲液(PBS)室温下固定15min。PBS洗2次，每次5min。0.2%的TritonX-100/PBS透化10min，PBS洗2次，5%牛血清白蛋白(BSA)封闭液，室温封闭30min。加入1∶400稀释的anti-α-synuclein204一抗室温孵育60min，PBS洗3次，每次5min。5%BSA封闭液，室温封闭20min。加入1∶200稀释的anti-鼠IgG-Cy2二抗100μl，避光室温下孵育60min。1×PBS洗3次，每次5min。4，6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)染细胞

7、核，室温，避光反应2min。PBS洗2次，每次5min。去离子水洗1次，封片，用激光共聚焦显微镜扫描和照相。　　1.2.4免疫印迹取细胞，吸去培养基，加入2×十二烷基硫酸钠(SDS)samplebuffer(125mmol/LTrisHCl，20%Glycerol，4%SDS，0.1%bromphenolblue，pH6.8)加入蛋白酶抑制剂cocktail裂解细胞，超声后，使用蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。均取20μg总蛋白经18%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，并电转移至PVDF膜上。以5%脱脂奶粉封闭1h后，加入相应

8、一抗，4℃过夜，Tris缓冲生理盐水溶液(TBST)洗膜后，加入对应的辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育60min，TBST洗膜后，电化学发光免疫分析法(ECL)发光，曝光。内参照为鼠抗-actin单克隆抗体。　　1.2.5细胞活力测定调节SH-SY5Y细胞密度约5×104/ml，以100μl/孔接种于96孔板，24h后分别转染pCDNA　　3