脑海绵状血管瘤遗传家系永生细胞株的建立

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1、脑海绵状血管瘤遗传家系永生细胞株的建立【关键词】血管瘤,海绵状中枢神经系统；疱疹病毒4型,人；B淋巴细胞；细胞系　　Establishmentofimmortallymphoblastoidcelllinesinapedigreeofcerebralcavernousmalformations　　【Abstract】AIM:Toestablishimmortallymphoblastoidcelllinesinapedigreeofcerebralcavernousmalformations(CCM).METHODS:Thecelllineseansofaddi

2、ngEpsteinBarrvirusandCyclosporineAontoperipheralBlymphocytes.RESULTS:.CONCLUSION:TheseimmortallymphoblastoidcelllineseofCCM.　　【Keyangioma,cavernous,centralnevvoussystem;herpesvirus4,human;Blymphocytes;Cellline　　【摘要】目的：建立脑海绵状血管瘤家系永生细胞株.方法：利用EB病毒转化外周血B淋巴细胞，同时加入环孢霉素A的方法.结果：成功建立了该疾病家系7名成

3、员永生细胞株，其中5名为患者.结论：脑海绵状血管瘤家系永生细胞株成功建立.　　【关键词】血管瘤，海绵状中枢神经系统；疱疹病毒4型，人；B淋巴细胞；细胞系　　0引言　　　　脑海绵状血管瘤(cerebralcavernousmalformation,CCM)是一种常见的脑血管先天性发育异常疾病，在临床上可分为家族性遗传和散发性遗传两大类.该病发病率高，病因复杂，对人危害很大，是医学和分子遗传学研究领域的热点之一〔1〕.利用EB病毒(EpsteinBarrvirus,EBV)转化外周血B淋巴细胞，使其成为能连续分裂永久生存的类淋巴母细胞(lymphoblastoid)

4、，以进一步建立各种疾患者群的永生细胞株(immortalizedcelllines)，可永久保存每种疾病个体的完整基因组，且基因组的生化和分子生物学特性不会发生变化，因而是进行细胞遗传学和分子遗传学研究极好的材料.我们以EBV加环孢霉素A（cyclosporineA,CyA）的转化技术，对采自内蒙古左旗地区一个遗传性CCM家系外周血淋巴细胞进行了转化，成功建立了该家系7名成员（5名为患者）的永生细胞株，从而为永久保存该疾病遗传资源以及今后进一步研究该病的发病机制提供了可靠的实验材料.　　1材料和方法　　1.1材料RPMI1640（Gibco）,Hepes（Gib

5、co）用去离子水配成1mol/L的溶液，胎牛血清（FCS,Hyclone，美国），淋巴细胞分离液(天津)，环孢霉素A（CyclosporineA,CyA，瑞士）用RPMI1640液稀释成0.2g/L的储存液，植物细胞凝集素（phaseolusvulgaris,PHA,Gibco）用去离子水配成0.2g/L的溶液，二甲基亚砜（Sigma），青、链霉素（双抗，宁夏启元药业）用去离子水配成10g/L的溶液，L谷氨酰胺（Sigma）用去离子水配成0.2mol/L的溶液，非洲狨猴Ｂ958细胞株（购自中国科学院遗传与发育生物学研究所），37℃CO2培养箱（Shellba,美

6、国）等.全培养液按照每1L含762mLRPMI1640,200mL胎牛血清，16mLHepes,12mLL谷氨酰胺，以及10mL双抗的比例配制；冻存液按950mL/L胎牛血清和50mL/L二甲基亚砜的比例配制，4℃保存备用.　　　　EBV液来自B958细胞株，提取时先复苏并培养B958细胞，当细胞处于指数生长期时，收集全部细胞悬液，反复冻融3次，再转移至离心管中，3000r/min离心15min，将上清液用0.22μm滤膜过滤后分装，-80℃保存.　　　　血液样本7份，均来自内蒙古左旗地区一个CCM遗传病家系，家系背景清楚.其中5人经核磁共振检查确诊为脑海绵状血

7、管瘤患者.在征得患者及其家属知情同意的情况下，无菌采集其新鲜外周血4mL至含0.5mL肝素的抗凝试管中，轻摇防止血液凝固，室温静置24h（CCM家系见图1）.本实验所采集7份样本分别为Ⅱ1,Ⅱ3,Ⅱ5,Ⅱ7,Ⅲ2,Ⅲ3,Ⅲ4等；其中Ⅱ1,Ⅱ3,Ⅱ5,Ⅱ7,Ⅲ3为该疾病确诊患者.　　图1遗传性脑海绵状血管瘤家系图（略）　　1.2方法将RPMI1640液2mL加入到所采集的抗凝血液中，充分混匀，然后将其缓慢地沿管壁移入预装有4mL已预热（37℃）淋巴细胞分离液的离心管中，室温3000r/min离心25min.用吸管小心吸取中间的淋巴细胞层，将其移入另一支15mL离心

8、管中，并加入不完全培养基