实习二电离辐射细胞存活克隆实验结果分析

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1、放射生物学实习二细胞克隆（集落）形成法评估电离辐射细胞增殖性死亡一、目的要求目的：了解细胞克隆（集落）形成法检测细胞存活能力的方法，熟悉细胞存活分数（SF,survivalfraction,inunitof%）与受照剂量（D,dose,inunitofGy）之间剂量－效应的关系，熟悉与细胞存活剂量效应模型曲线结果处理有关的软件及使用方法，掌握细胞存活模型曲线的绘制及重要参数的计算。要求：1，计算细胞接种效率(PE,plantingefficiency)；2，应用SPSS软件测算单击多靶模型下细胞

2、存活曲线的n、k估计值，评价模型曲线的拟合优度；3，根据n、k估计值进一步计算D0、Dq和D37等参数，以及某一化学增敏剂或处理因素的增敏比(SER,sensitiveenhancingratio)；4，利用EXCEL软件绘制细胞存活剂量效应的模型曲线。二、实验原理放射生物学中细胞受电离辐射照射后，受照细胞既可以呈现即刻死亡，也可能延迟一段时间后才表现出死亡，即增殖环节出现的细胞死亡。这是因为有些受照细胞形态上仍然保持细胞结构的完整，同时细胞还具有制造蛋白质、合成DNA，甚至再经历一次或数次细胞

3、的有丝分裂，但最终还是发生了细胞的变性死亡,这种并不立即表现出死亡的部分就称为细胞增殖性死亡。细胞增殖性死亡是放射生物学研究中最具特色的一类细胞死亡。细胞增殖性死亡与细胞凋亡是两个不同的概念，有关细胞增殖性死亡的分子生物学机制目前尚未完全清楚。一般而言,细胞增殖性死亡是不能经MTT实验、LDH漏出实验、或台盼蓝拒染法等加以检测。放射生物学上，人们通常采用细胞克隆（集落）形成试验来检测经电离辐射照射后，细胞在克隆性细胞增殖能力上的变化。一个存活的细胞克隆（集落）代表的是电离辐射细胞经一段时间（大约

4、10天）培养后，由独立分散的单个健在细胞直接分裂、增殖，尔后形成具一定细胞数量的群体（通常含50个以上细胞）。目前已有很多科学家正在努力探索用MTT实验方式达到简化或模拟细胞增殖性死亡的实验结果，从而用于药物辐射抵抗能力的筛选。9显而易见，细胞死亡的程度与细胞受照剂量的大小直接相关，但是在放射生物学中细胞死亡程度更多采用细胞存活分数来表示。哺乳类细胞受照后，单击多靶数学模型能较好地说明这种细胞存活与受照剂量之间相关性的数学规律。因此实践中一般就采用单击多靶数学模型对细胞存活分数与受照剂量各自之间

5、的原始数据进行拟合，从而获得细胞存活曲线的数学表达式及其一些重要的参数如D0、Dq、k和n等。在单击多靶细胞存活模型中，Dq值反映了细胞抵抗电离辐射修复亚致死性细胞损伤能力的大小。由此，人们还可以就未经处理的对照组与放射敏感剂处理组Dq值进行比较，求出两组之间Dq的比值，即获得该放射敏感剂的辐射增敏比SER。细胞存活分数（SF）与辐射剂量之间数学模型的建立哺乳类细胞受不同剂量电离辐射照射后，细胞存活的规律大多是符合单击多靶细胞模型，即根据实测细胞存活分数的原始数据对受照剂量进行非线性回归性拟合，

6、获得单击多靶细胞存活模型及其相关参数，如k、n、D0、Dq和D37。其中，k为细胞存活曲线的钝化常数，其值由拟合方程直接给出；n为外推数，理论上代表靶的数目，数值大小也是由拟合方程直接给出；D0为平均致死剂量，理论上D0是使每个细胞平均被击中一次所需要的辐射剂量，数值上D0＝1/k；Dq为准阈剂量，Dq表征修复亚致死损伤的能力，即克服单击多靶曲线中“肩宽”所需要的剂量，数值上Dq＝lnnxD0；D37是细胞存活分数相应于37%时所需要的辐射剂量，在单击多靶模型中D37＝D0+Dq。参数k、n、D

7、0、Dq和D37等在单击多靶细胞存活模型曲线中的位置见下图。9D0、Dq、D37以及SER值简单计算，公式如下。一、实验材料、设备条件与细胞存活曲线实验的基本步骤9实验材料与设备条件人宫颈癌HeLa细胞及其培养基；钴60伽马射线源；软件包括数学模型拟合用SPSS软件，曲线绘制用EXCEL软件。细胞准备与电离辐射的照射细胞照射前，取处于对数生长期的人宫颈癌HeLa细胞，用0.25%胰蛋白酶消化制成单个细胞悬液，计数细胞密度。设不加照射处理的1个对照组，以及0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8

8、.0Gy6个照射组（单纯照射对照组）。每增加一个受试化学增敏剂（仅一个剂量）处理时，都应设1个含该化学增敏剂但未经照射的对照组和6个含该化学增敏剂但经不同剂量照射的照射组，称为增敏剂处理照射组。25cm2培养瓶中，按0、0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0Gy剂量分组，每瓶对应分别接种细胞600、600、600、1000、4000、8000、10000个细胞，每组均设3个实验平行，37℃，5%CO2下添加培养基进行正常培养。细胞接种6－12小时后，细胞开始贴壁生长，然后根据需要将将培养