利用流式细胞仪分析细胞存活率、细胞周期、ros

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1、利用流式细胞仪分析细胞存活率、细胞周期、ROS（以6孔板为例）测定细胞存活率51.取对数生长期的细胞,以4×10/ml密度接种于6孔细胞培养板上；2.培养过夜后，用于相应实验处理；3.收集处理后的细胞培养液至流式专用管；4.加1mlPBS缓冲液清洗一次，清洗液加入管中；5.胰酶消化收集细胞于上述管中；6.1mlPBS缓冲液清洗剩余细胞一次，清洗液加入离心管；注：3－6步都收集于同一流式专用管。7.800g离心6min，去上清；8.加1mlPBS缓冲液重悬细胞，再次离心弃上清；9.最后重悬细胞于500l含5g/ml碘化丙啶(propidiumiodide,PI)的PBS缓冲液

2、中；10.避光冰上孵育10min,用流式细胞仪测定细胞存活率；11.PI可结合DNA，在一定波长的激发光作用下可发出荧光，其强度与DNA含量成正比，但其不能透过完整的细胞膜。而FS（前向散射）则是指示细胞大小的参数。因此，我们以FS为横坐标，PI的荧光值的对数（logPI）为纵坐标，就可将不同大小和不同荧光强度的细胞区分开：活细胞表现出较大的FS值和较弱的荧光强度；坏死的细胞碎片，由于丢失部分DNA，具有较小的FS值和较弱的荧光性；凋亡细胞的细胞膜具有通透性，细胞虽然聚缩变小，但核保持完整，所以显示出较小的FS值和较强的荧光强度。通过计算活细胞占所有细胞的百分率，即可得知细胞存

3、活率。测定细胞周期1.细胞的处理及收集同测定细胞存活率方法的第1-8步；2.用300l的PBS重悬细胞，将细胞逐滴加入700l预冷的无水乙醇中，乙醇终浓度为70%，4℃避光固定过夜；3.800g离心10min，去上清；4.PBS清洗两次；5.重悬细胞于500l含100unit/mlRNaseA的PBS缓冲液中，避光37℃孵育30min；6.加2mg/mlPI至终浓度50g/ml，避光孵育30min，7.以PI荧光读数为横坐标，细胞数为纵坐标，在流式细胞仪上计数细胞周期各期的细胞数目。测定胞内ROS的积聚1.细胞的处理及收集同测定细胞存活率方法的第1-8步；2.重悬细胞于

4、1ml的PBS缓冲液中；3.加荧光探针如CM-H2DCFDA（主要检测H2O2，1mol/ml），37℃孵育30min；4.在流式细胞仪上以FS和SS（侧向散射，指示细胞光透射程度）为参数，选取活细胞（大FS值，较小SS值），将其限定在Gate内，对Gate内的细胞进行ROS的分析。以相应荧光探针荧光读数的对数为横坐标，细胞数为纵坐标即可测定活细胞的ROS的相对强度。