实习二细胞存活曲线测试与结果分析

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1、实习二细胞存活曲线测试与结果分析一、目的要求实习目的是了解克隆形成法检测细胞存活曲线实验方法的原理与基本步骤，熟悉细胞存活分数与受照剂量（Gy）之间的剂量－效应关系，以及与存活曲线结果分析处理有关的软件使用，掌握细胞存活曲线的测试、绘制与结果分析的正确方法。具体要求：1，计算细胞接种效率PE；2，应用SPSS软件计算单击多靶模型下不同的n和k值，正确阅读运算结果；3，根据实际获得的n和k值，进一步计算出D0、Dq和D37值，以及增敏比SER；4，利用EXCEL软件计算出不同剂量照射下细胞的理论存活分数预测值，绘制存活分数预测值与照射剂量间

2、的剂量效应曲线。二、实验原理放射生物学中细胞死亡是指细胞丧失完整增殖能力的一种死亡。当细胞受到电离辐射照射后，受照细胞可呈现“间期死亡”，或曰即刻死亡，也可能呈现为“增殖性死亡”，即受照细胞形态上仍然保持完整，而且有能力制造蛋白质、合成DNA，甚至还能再经过一次或n次有丝分裂后，才突然变性死亡。鉴于上述细胞死亡定义和照射后细胞死亡的实际情况，细胞放射生物学通常采用细胞克隆（集落）形成试验来检测照射后细胞的存活状况。细胞克隆是在体外培养时由一独立的单个健康存活细胞直接分裂增殖而形成的细胞群体。在计数克隆数目时，通常把含50个以上细胞的克隆计

3、为一个细胞集落，代表一个存活细胞。在描述细胞存活分数（SF,survivalfraction）与电离辐射吸收剂量（Dose,Gy）间的定量关系时，通常有单击单靶和单击多靶两种模型。而哺乳类细胞受照后存活曲线多近似地符合单击多靶模型。根据模型对原始数据进行拟合分析可以获得细胞存活曲线的数学表达式及其具有生物学意义的一些参数。例如在单击多靶细胞克隆存活模型中，Dq值的大小反映细胞抵抗电离辐射修复亚致死损伤的能力。因此电离辐射细胞存活实验就是要通过检测与拟合细胞存活曲线，获得诸如D0、Dq、k和n等一系列参数，从而根据这些参数对细胞的放射敏感性

4、作出定量的评价。三、细胞存活曲线实验的基本步骤12细胞准备与照射细胞照射前，取体外培养处于对数生长期的人宫颈癌细胞HeLa细胞，用0.125%胰蛋白酶消化制成单细胞悬液，计数细胞浓度。设假照射对照组和0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0和10.0Gy7个照射组，每组设3个平行实验瓶。于25cm2培养瓶中，按剂量分组每瓶分别接种细胞100、200、400、1000、2000、4000、8000、16000个细胞，于37℃，5%CO2下正常培养。接种6－12小时后细胞已贴壁生长，将培养细胞转移至钴源室接受照射处理。其中，假照射对照组

5、细胞不接受照射处理。细胞培养、克隆计数与平均存活分数（SF）的计算将接受照射后的细胞放回细胞培养箱继续培养，每三天更换新鲜培养液一次。待培养至10－14天后弃去培养基，用0.5%结晶紫染色贴壁细胞。计数并记录不同照射剂量下各组培养瓶中细胞存活克隆个数。根据假照射处理组细胞克隆形成数目，计算细胞接种效率（PE）；各照射处理组细胞存活分数（SF）为各组细胞克隆形成的平均数除以相应细胞接种数与接种效率的乘积。细胞存活分数（SF）与辐射剂量之间数学模型的建立哺乳细胞接受不同剂量的电离辐射照射后，细胞存活的规律大多是符合单击多靶细胞存活模型，即12

6、SF＝1-[1-EXP（-k*D）**n]。根据实验实测细胞存活数据进行该数学模型的非线性回归拟合分析，可获得单击多靶细胞存活模型的一系列有意义的参数，如k、n、D0、D37和Dq。其中，k为细胞存活曲线的钝化常数，其值可由拟合曲线方程直接给出；n称外推数，代表理论上的靶数目，数值大小也是由拟合方程直接给出。D0、D37和Dq是根据k、n值演算出来的，D0称为平均致死剂量，是理论上使每个细胞平均被击中一次所需要的辐射剂量，数值上D0＝1/k；Dq称为准阈剂量，表征修复亚致死损伤的能力，即克服单击多靶曲线中“肩宽”的剂量，数值上Dq＝lnn

7、xD0；D37是细胞存活分数为37%时相应的辐射剂量，在单击多靶模型中D37＝D0+Dq。细胞存活单击多靶模型（下图）的表达式为：SF=1-(1-e-kD)nSPSS软件对单击多靶模型的数学拟合，求出模型中k和n参数值大致步骤如下：计算、整理不同辐射吸收剂量D下细胞的平均存活分数SF（校正接种效率后的平均存活分数，这是第一步），制成剂量D与存活分数SF的二维表格；启动SPSS软件,定义变量名D和SF、字段宽度以及小数点后位数，将SF显示精度定为小数点后4位数，并输入D和SF的原始数据；选择SPSS软件中非线性回归（Nonlinearreg

8、ression）窗口，将SF设置为因变量（Dependent），数学公式表达模型中输入1-[1-EXP[-k*D]**n]，同时将模型参数k和n迭代的起始值分别设置为0.0001，同时将模型参