体外重组技术唐旭东2013级

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1、第五章基因工程基本技术概述一、DNA重组技术相关概念克隆(clone)来自于同一始祖的一群相同分子、细菌、细胞或动物（常被成为副本或拷贝）。克隆化(cloning)获取大量单一拷贝的过程，也称无性繁殖。DNA克隆(DNAcloning)应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质（DNA）与载体DNA接合成一具有自我复制能力的DNA分子（复制子)-重组DNA。继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞。再进行扩增提取获得大量同一DNA分子的过程称为DNA克隆，又称为基因克隆(genecloning)或分子

2、克隆(molecularcloning)。※“克隆”某一基因或DNA片段过程中，将外源DNA插入载体分子所形成的复制子是杂合分子－嵌合DNA，所以DNA克隆又称重组DNA(recombinantDNA)。※实现DNA克隆所用的方法及相关的工作称DNA重组技术(recombinantDNAtechnology)，又称基因工程(geneticengineering)。※基因工程目的：①分离获得某一感兴趣的基因或DNA②获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）二、DNA重组技术基本程序外源DNA的获取连接物（重组DNA)导入合适受

3、体细胞目的基因与载体的连接克隆载体的选择与构建重组体的筛选克隆基因的表达分、切、接、转、筛（一）按功能分类（二）按受体细胞分类（三）按载体来源分类一、载体的分类克隆型载体表达型载体原核细胞载体真核细胞载体（穿梭载体）原核克隆型载体原核表达型载体真核转递型载体真核表达型载体质粒载体噬菌体载体病毒载体酵母人工染色体载体粘性载体细菌培养质粒扩增并表达蛋白质大肠杆菌染色质质粒定义:是存在于细菌染色体外的能独立复制的双链闭环的DNA分子，是能赋予细菌某些特性的辅助性遗传单位。二、不同载体的特点与分类（一）质粒载体1.质粒(pla

4、smid)的特征1.质粒的特征功能：使宿主细胞具有抵抗不利自身生长因素的能力。性质：具有不相容性按拷贝数分类：严谨性（低拷贝）松弛型（高拷贝）克隆用质粒载体应具备的特点：分子相对较小，具有较高的拷贝数含高效的复制子，可用氯霉素阻止细菌蛋白质的合成，使质粒的拷贝数增加。具有多种遗传选择标记，包括各种抗药基因或营养代谢基因等。2.质粒载体的分类:克隆载体和表达载体（1）克隆用质粒抗药基因或营养代谢基因氨苄青霉素抗性基因（ampr）:编码β-内酰胺酶，水解ampβ-内酰胺环使amp失效四环素抗性基因（tetr）：编码转膜泵将

5、tet从细胞移出大肠杆菌LacZ基因：编码半乳糖苷酶，分解X-gal，使菌落变为蓝色。*lacZN端146aa残基编码基因*lacZ编码产物为β半乳糖苷酶α片段（N端）,突变型lac–E.coli可表达该酶的ω片段（C端)，两片段单独存在无活性*两端同时存在时有活性-----蓝色化合物α互补（αcomplementation）*在LacZ基因内无外源DNA的插入，在含X-gal的培养基上生长时会出现蓝色菌落---阴性克隆。*在LacZ基因内插入外源DNA,在含X-gal的培养基上生长时会出现白色菌落---阳性克隆。X-

6、gal蓝色化合物-半乳糖苷酶Lac-Z基因α互补筛选-蓝白斑筛选外源DNA插入白色IPTG诱导异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)为半乳糖的类似物α互补筛选法-（2’37’’）阴性克隆阳性克隆AmprORITetrpBR322质粒：一种克隆质粒ORI：复制起始点，保证高拷贝自我复制。结构：Ampr,Tetr：两个抗性基因用于筛选阳性克隆。PstI,BamHI：两个单酶切位点用于插入目的基因AmprLacZMCSpfxBlue:克隆质粒MCS：MultipleCloningSite提供多个单酶切位点用于克隆操作La

7、cZ:蓝白斑筛选阳性克隆pUC18/pUC19pUC192686bpAmprLacZP(BLA)OriAvaI(413)BamHI(418)EcoRI(397)HindIII(448)PstI(440)SmaI(415)XmaI(413)ApaLI(178)ApaLI(1121)ApaLI(2367)MCS*pUC18/pUC19的MCS方向相反pMD-18Tsimple克隆载体的结构2.质粒载体的分类:（2）表达用质粒载体：除具备载体的必备条件外还应有用于外源基因表达的元件：如启动子、终止子等分类：原核表达载体真核表

8、达载体pET-32a(+)原核表达载体的结构*pET系列的基本结构：T7启动子、MCS、T7终止子、Ampr等Amprlac*可将T7RNA聚合酶基因置于lac启动子的控制下pcDNA3：真核细胞表达质粒Pcmv：CMV增强子/启动子驱动目的基因在真核细胞内表达BGHpA：加尾信号目的基因转录后加上polyA尾，使其更稳定。（二）