酪蛋白的提取

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1、一、实验目的1、掌握一种提取蛋白的方法。　　2、掌握一种检测牛乳质量的方法。二、实验原理酪蛋白是乳蛋白质中最丰富的一类蛋白质，约占乳蛋白的80~82%，酪蛋白不是单一的蛋白质，是一类含磷的复合蛋白质混合物，以一磷酸酯键与苏氨酸及丝氨酸的羟基相结合。它还含有胱氨酸和蛋氨酸这两种含硫氨基酸，但不含半胱氨酸。它在牛乳中的含量约为35g/L，比较稳定，利用这一性质，可以检测牛乳中是否掺假。酪蛋白在其等电点时由于静电荷为零，同种电荷间的排斥作用消失，溶解度很低，利用这一性质，经牛乳调到pH4.6，酪蛋白就从牛乳中分离出来。酪蛋白不溶于乙醇，这个性

2、质被利用来从酪蛋白粗制剂中将脂类杂质除去。三、仪器和试剂仪器：温度计、布氏漏斗、pH试纸、抽滤瓶、电炉、烧杯、量筒、表面皿、天平等。试剂：　　1.95%乙醇、乙醚　　2.pH4.6乙酸钠缓冲液0.2mol/L　　3.乙醇、乙醚混合液：乙醇∶乙醚=1∶1（体积比）　　4.市售牛乳四、实验步骤1.酪蛋白等电点沉淀　　将100ml牛乳放到500ml烧杯中，加热至40℃左右的乙酸钠缓冲液，直到pH达4.6左右，用pH试纸或酸度计调试。将上述悬浮液冷却至室温，然后放置5min，用细布过滤，收集沉淀。2.除脂类杂质　　将上述沉淀用少量水洗数次，然后

3、悬浮于30ml95%的乙醇中。将此悬浮液倾于布氏漏斗中，抽滤除去乙醇溶液，再倒入乙醇—乙醚混合液洗涤沉淀两次，最后再用一米洗涤沉淀两次，抽干。将沉淀从布氏漏斗中移去，在表面皿上摊开以除去乙醚，干燥后得到的是酪蛋白纯品。准确称重后，计算出每100ml牛乳所制备出的酪蛋白数量（g%），并与理论产量（3.5g%）相比较，求出实际获得百分率。一、实验目的酶是植物体内具有催化作用的蛋白质，植物体内的生化反应，一般都是在酶的作用下进行的，没有酶的催化反应，植物的生命也就停止了，因此对酶的研究是阐明生命现象本质中十分重要的部分。为要研究酶首先要将酶从

4、组织中提取出来，加以分离、纯化，不同的研究目的对酶制剂的纯度要求也不相同，有些工作只需要粗的酶制剂即可，而有些工作则要求较纯的酶制剂，需根据不同情况区别对待。在酶的提取和纯化过程中，自始至终都需要测定酶的活性，通过酶活性的测定以监测酶的去向。二、实验原理（一）酶的提取1.酶的存在位置? 　　存在于动植物以及微生物的细胞的各个部位。2.如何将酶从细胞中分离?　　从高等植物中提取酶常遇到一些实际问题，首先是细胞中含有许多种酶，每种酶的浓度又很低，只占细胞总蛋白质中的极小部分（叶中的双磷酸核酮糖羧化酶除外），而许多植物组织中蛋白质的含量又很低

5、。此外，各种酶的存在状态不同，有在细胞外的外酶，在细胞内的内酶，内酶中又有与细胞器一定结构相结合的结合酶，也有的存在于细胞质中，提取时都应区别对待，作不同处理。如果酶仅存在于细胞质中，只要将细胞破碎，酶就会转移到提取液中；但如果是与细胞器（如细胞壁、细胞核、线粒体、原生质膜、微粒体等）紧密结合的酶，这时如仅仅破碎细胞还不够，还需要用适当的方法将酶从这些结构上溶解下来。其次，细胞中存在抑制物质，如酚，酸，离子等，它们通常在液泡中，当细胞破碎时，这些物质象蛋白质一样从细胞中释放出来，进入提取液中，特别是酚类物质，具有游离的酚羟基，能与蛋白质

6、肽键的氧原子形成强的氢键，不能为一般的实验方法，如透析和凝胶过滤所解离。酚易氧化产生醌，醌为一种强氧化剂，会使蛋白质的功能团发生氧化或发生聚合，使蛋白质上的反应基团，如-SH，-NH2，通过1，4-加成反应而发生不可逆的聚合作用，使酶失活，也使植物组织和提取液产生棕色，以致影响酶活性的测定。因此如果没有特殊需要，一般常选用植物的非绿色部分或者黄化的幼苗，在这些组织中一般酚类化合物含量较低。在提取过程中为了尽量减少酚类的影响，一般提取液常选用高pH值的缓冲溶液，因为在高pH值时，酚类大部游离而不与蛋白质形成强的氢键，但高pH值促进酚类氧化

7、，同时降低酚类吸附剂（如PVP）的有效性，通常采用pH6.7梍7.2。已经知道PVP能与游离酚羟基形成强的氢键复合物，是酚类化合物的有效结合剂。在提取线粒体时加入可溶性PVP，提取可溶性酶时加入不溶性交联PVP（Polyvinylpolypyrrolidone，简称PVPP，或PolyclarAT），能有效地降低提取液中酚的含量。PVPP含有微量金属元素及PVP单体，可加10%HCl煮沸10分钟，用NaOH中和，再用水洗几次，直至中性，纯化后的PVPP不必干燥就可直接应用。　　植物细胞有坚韧的细胞壁，需要强烈的方法去破碎，少量样品可用研

8、钵加石英砂研磨，或用玻璃匀浆器。大量样品则需用电动匀浆器。为减低研磨或匀浆过程中发热，所用器皿和溶液需要预冷，提取液的用量一般为组织的1梍5倍，用量大些有利于提高得率，但工作量大，一般宁可用量小些，将残渣再