肠道标本的细菌学检查

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1、粪便标本的细菌学检验第八组目的与要求掌握粪便标本的方法掌握粪便标本的细菌学检验程序与方法Background正常人的肠道中栖居大量的不同种类的微生物，组成人类健康极为重要的体内微生态环境——参与营养、消化、吸收及清洁肠道，维护健康的作用。腹泻因病原菌或病毒在在肠道繁殖引发，引起腹泻细菌种类多。本实验主要介绍疑为沙门菌或志贺菌属感染者或带菌者的粪便标本（或直肠拭子）中致病菌的分离和鉴定。由于肠道中存在大肠埃希菌等很多条件致病菌，其与肠道致病菌的主要区别之一是：大多数条件致病菌可分解乳糖，而绝大多数肠道致病菌则不分解乳糖。分离肠道致病菌多用含乳糖的弱选择性鉴别培养液（如麦康凯琼脂等

2、）以及对大肠埃希菌等条件致病菌有较强抑制作用、而又有利于肠道某些致病菌（如沙门菌及志贺菌属）生长繁殖的强选择性鉴别培养液。BackgroundBackground粪便标本常见的病原菌：■G＋菌：葡萄球菌属、白色假丝酵母菌、艰难梭菌、结核分枝杆菌、蜡样芽孢杆菌■G－菌：志贺菌、沙门菌、致病性大肠埃希菌、霍乱弧菌、亲水气单胞菌、类志贺邻单胞菌、弯曲菌、小肠结肠炎耶尔森菌试剂与器材菌株：伤寒沙门菌培养基：麦康凯和SS琼脂平板各种生化反应培养液及革兰氏染液等试剂（可参见微生物的自动分析及附录）沙门菌多价“O”（A-F组）及单价“O”诊断血清、“H”因子诊断血清标本的采集由于粪便中细菌种

3、类很多，故应根据检查目的的不同选择适宜的培养液或用适当方法处理，尽可能地抑制杂菌，以利于病原菌的检出。不能认为粪便中细菌含量多，粪便标本的采集就无须无菌操作。粪便标本的采集也应遵循无菌操作的原则。若便器或标本容器不洁而污染了变形杆菌，就可能影响病原菌的分离检出，甚至把污染菌误报，造成误诊。标本的采集采样的时期应合适。疑似痢疾患者应在发病初期、用药前采取标本。粪便标本采集时应挑取无尿液污染的有脓血、黏液部分的粪便2—3g（液状粪便可挑取絮状物），盛于无菌容器内送检。在无法获得粪便时，可采用直肠拭子，即用灭菌棉拭子经0.9%氯化钠溶液或增菌培养液湿润后，插入肛门内)4—5cm处，轻

4、轻转动一圈后取出，插入无菌试管（CaryBlair系统运送管）或保存液中送检；疑似伤寒患者应在发病2—3周内采集粪便标本。标本的采集在无法获得粪便时，可采用直肠拭子，即用灭菌棉拭子经0.9%氯化钠溶液或增菌培养液湿润后，插入肛门内)4—5cm处，轻轻转动一圈后取出，插入无菌试管（CaryBlair，卡—布系统运送管）或保存液中送检；应采集可疑粪便，如立即患者粘液脓血便、霍乱患者的米泔水样便等。以为换乱患者，硬质碱性蛋白胨水中。除婴幼儿外，不推荐用棉拭子做常规病原菌培养。粪便标本如不能立即送检，可将标本放入甘油盐水保存液中，或保存于冰箱内（勿超过2小时）。粪便标本的细菌学检验程序

5、粪便标本或肛拭子道标本涂片增菌培养直接分离报告革兰染色；动力学观察与制动试验（KIA、MIU）初步报告需氧培养GN增菌液或亚硒酸增菌液碱性蛋白胨TCBS平板或其它碱性平板分离SS平板MAC平板EMB平板副溶血性弧菌选择平板菌落形态生化反应菌落形态、生化反应、抗血清凝集药敏菌落形态、生化反应、抗血清凝集药敏步骤与方法革兰氏染色志贺菌与沙门菌：急性腹泻患者的粪便标本划线接种于SS平板和MAC平板。慢性腹泻患者志贺菌或携带者应接种GN增菌液，沙门菌接种亚硒酸盐增菌液，再转种SS平板与MAC平板，观察小的、透明或半透明、无色或浅黄色的可以菌落生长，有时SS平板可见中心黑色菌落（H2S）

6、。挑选三个可疑菌落分别接种三支KIA、MIU培养基，观察结果。挑取菌落进行革兰氏染色，观察细菌形态、排列。采用伤寒沙门菌诊断血清进行血清学鉴定。步骤与方法生化反应鉴定第2日观察平板上有无可疑菌落，用接种针于上述平板中挑取单个可疑菌落（无色、半透明、光滑、较小）2—3个，分别接种至2—3管双糖培养液内，置37℃培养18—24h。第3日观察细菌生长情况，根据表10—2初步鉴定细菌种类，然后取双糖培养液上的菌落进行系列生化鉴定。表不同肠道细菌在双糖培养液培养结果（教学实验模拟标本的结果）序号上层（乳糖）下层（葡萄糖）动力可能结果1++有大肠埃希菌2—+有伤寒沙门菌3—+无痢疾志贺菌步

7、骤与方法血清学最终鉴定根据双糖培养液及系列生化反应结果判断，最后利用血清学实验对细菌进行最后的确定。如果初步鉴定结果为沙门菌属，则取双糖培养液斜面上菌苔与沙门菌多价“O”（A-F组）诊断血清作玻片凝集实验，如凝集即为沙门菌属，然后分别与A-F组的单价“O”诊断血清作玻片凝集实验定组，最后以H因子诊断血清作玻片凝集实验以定型（种），必要时可用因子诊断血清定型。如果根据双糖培养液及系列生化反应结果判断，初步鉴定结果为志贺菌属，则取菌苔与志贺菌属多价诊断血清作玻片凝集实验以定组，必要时可用因子诊断