抗肿瘤转移机制的实验方法学研究进展

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1、抗肿瘤转移机制的实验方法学研宄进展肿瘤转移是是恶性肿瘤的一个重要表现，是指肿瘤细胞从原发部位侵入血管、淋巴管或体腔，在新的部位由于血管生成而继续生长，从而形成与原发瘤相同类型肿瘤的过程。主要经淋巴管、血道转移，它的山现往往标志着预后不良，大多数的癌症患者死亡与肿瘤转移密切相关［11。肿瘤转移是一个多阶段的复杂过程，大体归纳如下：即机体内原发部位的肿瘤细胞在生长过程中细胞内部的骨架发生重排、变形，从而脱落侵入细胞外基质（ECM）,酶解ECM进入循环系统,在循环系统释放的血管生成因子与内皮细胞特异性受体结合后，生成新的血管，瘤细胞在血管构建的“骨架”上增殖，形

2、成一个新的癌巢，再脱离出循环系统，在机体某个点定居下来，并逐渐增殖成长为一个新的肿瘤瘤块的一系列过程。如果肿瘤细胞反复转移，后果则相当的严重。这是目前肿瘤难治的一个主要原因，所以研究抗肿瘤药物抗肿瘤转移的机制，从而筛选、开发出新的能促进机体抗肿瘤转移的药物是非常重要的。抗肿瘤转移机制的药理实验方法主要涉及到以下几个方面：1.建立肿瘤转移的动物模型一般以大鼠、裸鼠为常用动物模型。将FI标瘤细胞如SGC-7901胃癌细胞株、S180肝癌细胞株等置于含10%小牛血清的RPMI-1640培养基屮，培养箱条件为37°C,5%CO2进行细胞培养，0.1%胰酶消化传代后

3、制备细胞悬液，之后将细胞悬液以皮下注射或腹腔注射的方式，将肿瘤移植入动物体内。黄挺M等人采用皮下接种W256癌肉瘤的方法建立了Wistar大鼠的肝癌转移模型；魏锦来通过腋下接种SGC-7901细胞悬液的方式建立了裸鼠的胃癌原位移植瘤动物模型。此外还有尾静脉注射、裸鼠脑部右尾状核注射人肿瘤组织制备的细胞悬液等方式接种。现阶段裸鼠的应用对于肿瘤方面的研究更有意义，因为裸鼠体表无毛，苏先天性缺乏T淋巴细胞，免疫功能低于别的实验动物，更容易进行异种肿瘤的移植。而大鼠由于价格相对便宜而应用较为广泛。此外也可用C57BL/6小鼠等动物建立动物模型。均应在无菌条件下进行

4、造模，以免细菌等微生物产生污染。2.观察转移情况肿瘤转移的动物模型建立以后，需对动物进行分组实验研究。一般分为空白对照组、药物组、阳性药对照组等。薛晓红等人在进行乳宁冲剂及其拆方对裸鼠移植瘤肺转移的抑制作用及机制时将裸鼠分为6组，每组8只，7周后处死裸鼠，取出原发部位肿瘤和肺，分别称重、检测原发部位肿瘤体积和肺部肿瘤转移情况。观察转移情况的方法是：将组织块固定于含奋甲醛的固定液中24小吋，电子显微镜观察组织表面灰白色结节的数目，即可求出各组平均转移数和转移抑制率。肿瘤转移的好发部位通常是淋巴结、肺部、肝脏甚至脑部，通常需耍重点观察这些部位，男外由于肿瘤转移

5、会通过血管，因此还需检査血液的转移情况。一般要在动物建立肿瘤模型的7-10周后才可处死动物观察转移情况，时间过短可能还不能发生转移，吋间过长则可能导致动物的死亡。1.MMP、VEGF的检测MMP是一种参与肿瘤转移的内源性蛋白酶，其全名是基质金属蛋白酶（matrixmetalloproteinases,MMP）,主要分为MMP-2、MMP-9等成分。人体的成纤维细胞、巨噬细胞甚至一部分肿瘤细胞都会分泌出这种酶，其在纤溶酶等外源性酶的作用下，被激活从而酶解细胞外基质（ECM），使肿瘤细胞越过由ECM构成的天然屏障，进入循环系统，MMP的含量增加能导致肿瘤转移的

6、侵袭性更强。［5］此外它还会与血管生成因子（VEGF）结合诱导血管的生成，VEGF是由肿瘤细胞或巨噬细胞分泌的，其能促进内皮细胞分裂、毛细血管出芽、促进蛋0酶的生成、刺激内皮细胞游走，最终导致新生毛细血管的生成。［6］血管生成构成了肿瘤形成的物质基础，为肿瘤转移提供了优厚的条件。［7］研究抗肿瘤药物是否能抑制MMP、VEGF的表达，从而发挥抗肿瘤转移作用。一般采用免疫组化法（SP-ABC）检测蛋白表达水平。鲁荤［8］等人所采用的SP方法是：将对数生长期的细胞接种于6孔培养板，分为实验组和对照组，实验组加入一定浓度的药物后培养一段时间，再用PBS洗涤、乙醇固

7、定；之后使用抗蛋A抗体进行SP染色；最后在显微镜下计算阳性细胞和阴性细胞的数0，比较出阳性染色和阴性染色。魏锦来采用免疫组织化学-SABC法检测MMP-9、VEGF的蛋白表达水平，通过Western印迹法检测蛋白质含量，发现药物组的瘤块MMP-9、VEGF的表达水平较低，蛋白质含量下降，即药物下调了MMP-9、VEGF的表达，有一定的抗肿瘤转移作用。Arrestcn一种新近发现的强效血管生成抑制因子，其抑制血管生成的作用显著强于内皮素，很有希望被研制成新一代的抗肿瘤血管生成抑制剂。龙淼云等人通过在结肠癌细胞LoVo中导入arresteri基因，并将其接种至

8、裸鼠，建立结肠癌肝转移模型，观察arresten对肿瘤转移的作用。