绿色荧光蛋白(gfp)技术在细胞生物学研究中的应用ppt课件

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1、绿色荧光蛋白(GFP)技术在细胞生物学研究中的应用荧光现象在许多海洋无脊椎动物中普遍存在着。许多刺胞亚门的动物和几乎所有栉水母类的动物在受到刺激时都可以发出荧光：刺胞亚门的动物多发射绿色荧光，而栉水母类发射蓝色荧光。绿色萤光蛋白(greenfluorescentprotein)，简称GFP，它的发现和应用被称为细胞生物学上的一次革命。这种蛋白质结构很特殊，在受到蓝光或紫外线刺激时可以发射绿色荧光，并不需要任何协同因子、底物，适合用作普遍的报告标记，尤其适合于活体细胞或组织。由于GFP稳定、灵敏度高、无生物毒性、荧光反应不需要任何外源反应底物及表达无物种或细胞组织的专一性,检测简单，结果真实

2、可靠，是一种独特的报告蛋白(Reporterprotein)。可广泛用于基因的表达与调控、蛋白质的定位、转移及相互作用、信号传递、转染与转化,以及细胞的分离与纯化等研究领域。图1绿色荧光蛋白1962年Shimomura和Johnson等人[1]首先从一种水母类动物AequoreaVictoria中分离纯化出了GFP,1992年Prasher[2]等克隆了GFP基因的cDNA并分析了GFP的一级结构,1994年M.Chalfie[3]等最早用重组野生GFP型基因做报告基因,成功地在原核和真核生物中得到表达。90年代后,人们对GFP的性质和应用进行了不断深入的研究,有关GFP及其利用的研究进展

3、较快，现在它已经发展成了现代生物学研究的一个精确工具。目前在细胞生物学、植物学、动物学、微生物学等学科研究中都有着相当广泛的应用。随着人们对GFP发光机制研究的深入,通过对其发光团区域和其它区域进行随机诱变,已经得到了许多GFP突变型,有的发蓝光或黄光而不是绿光[4]；有的发出的荧光比野生型的强很多,激发后很容易用肉眼观察到；有的则是温度突变型,其表达不受温度的限制[5]；有的突变体则可以特异地在某些物种中高效表达。这些突变体极大地拓宽了GFP的应用范围,使GFP在细胞生物学和分子生物学领域的应用显示出更为广阔和诱人的前景。一、GFP的结构图2绿色荧光蛋白结构GFP编码238个氨基酸的多肽

4、单体，只有完整的GFP分子才会产生生物荧光，被切断的GFP(即使是C、N末端的少数几个氨基酸)亦能导致GFP失去发光能力[6]。与荧光的产生直接有关的是GFP分子中一小段被称为荧光生色团(Chromophore)的部位[7]。在GFP的初级氨基酸序列上，第65～67个氨基酸(Ser-Tyr-Gty)形成环状三肽，以共价形式与GFP蛋白肽键骨架相连。生色团的形成不受种属的限制，其通过细胞内广泛存在的成分的作用或通过自催化作用都能产生。荧光生色团非常稳定,不易变性,用酸、碱处理或者加入盐酸胍都不会使它失去荧光。但是当pH值恢复到中性或者移去变性物时，它的荧光又会恢复到变性前的水平。GFP的生色

5、团之间是通过共价键结合。生色团形成的机理目前尚不清楚，但在有分子氧存在的条件下，酪氨酸氧化成脱氢酪氨酸，并环化形成六肽，这可能是形成色基的必然过程。[8]3广谱性首先表现在它的表达几乎不受种属范围的限制，在微生物、植物、动物中都获得了成功的表达；其次就是没有细胞种类和位置的限制，在各个部位都可以表达，发出荧光。4易于载体构建由于GFP较小，只含有238个氨基酸，编码GFP的基因序列也较短，约2.6kb，所以它可以很方便地同其它序列一起构建多种质粒，而不至于使质粒过大影响转化频率。尽管野生型的GFP在某些植物和动物中表达很弱，但可通过更换GFP生色团氨基酸、改变碱基组分、除去内含子、更换强启

6、动子等方法加强表达。Connack等筛选出了三种含Ser65突变的突变体，在大肠杆菌中表达时，荧光强度比野生型高约100倍。5无毒害Chalfie等的研究表明：GFP对生活细胞基本无毒害，Sheen等(1995)的研究进一步表明：在玉米中，即便GFP在细胞中的表达量很高时，对细胞也不会产生明显毒害。但是至今我们还不太了解它对植物再生能力的影响。三、GFP在细胞生物学研究中的应用1对细胞生理过程的监控在过去的几年中，通过随机和人工诱变得到了许多不同颜色的GFP突变体。通过基因操作，许多蛋白都成功的与GFP进行了融合，通过这些融合蛋白就可以对相应蛋白的表达和转运及生理反应进行监控。目前GFP融

7、合蛋白对细胞内迅速的生理反应的报告大概有三种方式：转移和定位、GFP光谱的生化修饰、荧光共振的能量转移(FRET)。Shen[10]等在培养的神经元中发现，细胞内的Ca2+瞬间变化就会引起GFP标记的钙调蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)可逆地易位到突触后膜的densities上。Shi[11]等用GFP标记来监控α-氨基羟甲基恶唑丙酸(AMPA)的受体，发现它会从细胞内膜转移到树突棘的表面，根据突触中AMPA受体的含量可以解释突