1112010611基于dna的腔蛤蜊属贝类分类学研究成果材料李惠茹docx

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1、项目编号1112010611项目分类自然科学√社会科学中国海洋大学本科生研究发展计划（OUC-SRDP）项目成果支撑材料项目名称：基于DNA的腔蛤蜊属贝类分类学研究负责人：李惠茹所在学院：水产学院专业年级：2009级水产养殖学指导教师:孔令锋起止年月：2011年6月至2012年4月联系电话：13589330943电子邮箱：lihuiru923@163.com二○一二年五月十一日本科生研究发展计划（SRDP）管理委员会――研究报告――基于DNA的腔蛤蜊属贝类分类学研究李惠茹金奖笑（中国海洋大学山东青岛266003）摘要：采用聚合酶链

2、式反应（PCR）技术对我国南北方西施舌及古氏腔蛤蜊24个个体的mtDNACOI基因进行扩增，PCR产物经纯化后进行测序，结果经比对校正后，获得COI基因片段序列24条，本研究选取了测序完整的22条COI序列进行分析比对后COI基因序列长602bp，检测到117个变异位点，其中有113个简约信息位点，核苷酸多样性为0.03217。COI基因序列中四种碱基比例为T40.7%、C14.5%、A23.2%、G21.6%，A+T含量丰富63.9%，明显高于G+C含量36.1%，这与虾类、蟹类、贝类等发现的规律一致。从第2个碱基开始翻译，60

3、2bp的COI基因序列翻译成200个氨基酸，所有变异位点未导致氨基酸序列的变化。研究发现西施舌北方个体与同属的古氏腔蛤蜊平均遗传距离（Kimura-2-paremeter）为13.5%，而与西施舌南方个体平均遗传距离为15.1%，NJ树上西施舌北方产个体更是先与克氏腔蛤蜊聚为一支，表明西施舌南北方群体应为腔蛤蜊属的姊妹种。关键词：腔蛤蜊属；COI序列；分类；隐存种1、前言西施舌（Coelomactraantiquata）和古氏腔蛤蜊（Coelomactracumingii）隶属于软体动物门（Mollusca），双壳纲（Bivalv

4、ia），异齿亚纲（Heterodonta），帘蛤目（Veneroida），蛤蜊科（Mactridae），腔蛤蜊属（Coelomactra），是腔蛤蜊属仅有的两个种类。西施舌俗称“海蚌”，自然分布于我国的南北沿海，日本和朝鲜半岛，是一种经济价值很高的名贵海产双壳贝类。据不完全统计，上世纪80～90年代，广东的粤东沿海、福建的长乐与江苏、山东等地的西施舌年产量近万吨。近年来，由于海域污染和滥捕，西施舌资源得不到合理的保护，在我国沿海大部分地区西施舌资源量已大幅度减少，2002年全国沿海西施舌年产量仅约1000吨，2004年约50吨，一

5、些海区已很少见到西施舌的踪迹。古氏腔蛤蜊自然分布于我国海南至澳大利亚北部，由于个体较大，是潜水作业的主要捕捞对象，造成目前种群数量下降，海南岛已经比较少见。在2005年出版的《中国物种红色名录•第三卷•无脊椎动物》一书中，腔蛤蜊属的这两个种类都已经被列为濒危物种。了解濒危物种的遗传背景是采取有效合理保护措施的必要基础。基于核基因和线粒体序列的分子标记（同工酶、扩增片段程度多态性AFLP和16SrDNA）揭示了西施舌南方种群和北方种群可能是不同的隐存种或姊妹种。进一步研究西施舌南方种群、北方种群与同属的古氏腔蛤蜊之间的系统发生关系对

6、正确解读西施舌南北方种群的分类地位十分必要。目前，用DNA序列分析来研究物种的遗传差异和分类关系，已在多种海洋贝类中得到应用。本研究将对西施舌和古氏腔蛤蜊线粒体COI基因的特定区段进行测序，计算西施舌南北群体和古氏腔蛤蜊的分子遗传距离，构建系统发生树，阐明西施舌南北方种群的分类地位以及腔蛤蜊属种类的系统发生关系。2、材料和方法2.1样品采集本研究所使用的西施舌及古氏腔蛤蜊样品为中国海洋大学贝类遗传育种研究室2006-2011年自我国南部沿海水域采集，保存于95%酒精。2.2DNA提取、PCR扩增、产物纯化及测序采用CTAB法抽提样

7、品的DNA。线粒体COI序列使用Mikkelsenetal.（2006）的引物进行扩增：COI-F（5'ACAAATCAYAARGAYATYGG3'）和COI-R（5'TTCAAGRTGNCCRAARAAYCA3'）。PCR采用50μL反应体系，含1×buffer，MgCl21.5mmol/L，dNTP200μmol/L，Taq聚合酶（TaKaRa）1.25U，正、反引物各10μmol/L，模板DNA100ng。PCR反应参数为：94℃预变性5min；94℃变性30s，48℃退火1min，72℃延伸30s，35个循环，最终72℃延

8、伸7min。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后由上海生物工程有限公司进行双向测序。2.3数据处理利用DNAStar7.2.1软件包中的SeqMan软件对序列进行正反向拼接，当正反序列出现不配对情况时，查阅原始荧光图谱进行校正；得到的一致序列在MEG