2014级硕士高级免疫学实验技术elisa课件

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1、高级免疫学实验技术2014级硕士研究生吉林大学基础医学院免疫学系酶联免疫吸附试验(Enzymelinkedimmuno-sorbentAssay,ELISA)间接法-测抗OVA抗体的效价实验原理实验分组、试剂与器材试剂：封闭液(1%PBS-脱脂奶粉)7ml洗液(PBS-Tween20)1瓶抗OVA抗体ml酶标抗体(HRP-GaM)5ml底物5ml终止液(H2SO4)2.5ml器材：酶标板1块200lpipette1把1000lpipette1把Tip(大/小)若干1.5mlEP管若干培养箱43℃1

2、个吸水纸若干四人一组，每人做一排注意事项清点好实验物品加样器的正确使用加样器头不能混用，尤其是吸酶和底物底物应现用现配包被：用0.05MPH9.6碳酸盐包被缓冲液将抗原(OVA，10g/ml)稀释。100l/well加入聚苯乙烯酶标板中，4℃overnight。封闭：次日，弃去孔内溶液。加入150l/well1%PBS-脱脂奶粉(封闭液),43℃for60mins。加样：弃去封闭液，加倍比稀释的抗OVA抗体100l/孔，43℃孵育40mins。孵育结束后，用PBS-T洗三次，每次5min。酶抗

3、：酶标抗体(HRP-羊抗鼠IgG)，100l/well，置43℃孵育40mins，用PBS-T洗三次，每次5min。显色：于各反应孔中加入新鲜配制的底物溶液100l/well，室温下避光显色。终止：加50l/well2M硫酸(终止液)。(alteringthepH)判定：肉眼观察：与阴性对照孔相比有明显呈色反应的为阳性孔，相对应的抗体的稀释度倒数为该抗体的效价。酶标仪测量：490nm滤光片下测光吸收值(A)，与阴性对照相比其A值≥2，相对应的抗体稀释度为该抗体的效价。封闭(blocking)高浓

4、度的无关蛋白质包被时所用的抗原或抗体浓度较低，吸收后固相载体表面尚有未被占据的空隙，封闭就是让大量不相关的蛋白质充填这些空隙，从而排斥在ELISA其后的步骤中干扰物质的再吸附。见图：EEEEEECoatingBlockingAfterblockingAfterblockingWithoutblockingEffectofBlocking最常用的封闭剂：0.5%-1%的牛血清白蛋白（BSA）10%的小牛血清1%明胶洗液（磷酸盐缓冲液，PBS-T）磷酸盐缓冲液：（PBS）吐温20（Tween20):抑制蛋

5、白质吸附于塑料表面的非离子型表面活性剂抑制非特异性吸附包被：用0.05MPH9.6碳酸盐包被缓冲液将抗原(OVA，10g/ml)稀释。100l/well加入聚苯乙烯酶标板中，4℃overnight。封闭：次日，弃去孔内溶液。加入150l/well1%PBS-脱脂奶粉(封闭液）,43℃for60min。加样：弃去封闭液，加倍比稀释的抗OVA抗体100l/孔，（稀释与加板方法）。43℃孵育40mins。孵育结束后，用PBS-T洗三次，每次5min。酶抗：酶标抗体(HRP-羊抗鼠IgG)，100l

6、/well，置43℃孵育40mins，用PBS-T洗三次，每次5min。显色：于各反应孔中加入新鲜配制的底物溶液100l/well，室温下避光显色。终止：加50l/well2M硫酸(终止液)。(alteringthepH)判定：肉眼观察：与阴性对照孔相比有明显呈色反应的为阳性孔，相对应的抗体的稀释度倒数为该抗体的效价。酶标仪测量：490nm滤光片下测光吸收值(A)，与阴性对照相比其A值≥2，相对应的抗体稀释度为该抗体的效价。样品的稀释抗OVA抗体（样品）的稀释方法抗体原液稀释度是1:40女女120

7、lPBS-T120l抗OVA抗体（1：40）120ul1:1601:3201:6401:25601:12801:80加板方法1:3201:640Ab-Ag-1:401:12801:401:801:1601:2560Ag-Ab-包被：用0.05MPH9.6碳酸盐包被缓冲液将抗原(OVA，10g/ml)稀释。100l/well加入聚苯乙烯酶标板中，4℃overnight。封闭：次日，弃去孔内溶液。加入150l/well1%PBS-脱脂奶粉(封闭液）,43℃for60mins。加样：弃去封闭液，加

8、倍比稀释的抗OVA抗体100l/孔，43℃孵育40mins。孵育结束后，用PBS-T洗三次，每次5min。酶抗：酶标抗体(HRP-羊抗鼠IgG)，100l/well，置43℃孵育40mins，用PBS-T洗三次，每次5min。显色：于各反应孔中加入新鲜配制的底物溶液100l/well，室温下避光显色。终止：加50l/well2M硫酸(终止液)。(alteringthepH)判定：肉眼观察：与阴性对照孔相比有明显呈色反应的为阳性孔，相对应的抗体的稀