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1、实验六现代免疫学检测技术：ELISA1.了解ELISA的原理及其优点，2.掌握试剂盒的使用。3.学习ELISA的实验操作过程及其应用。一、实验目的免疫酶技术（酶免疫测定法）免疫酶技术:将抗原抗体反应的特异性，与酶反应的敏感性相结合的一种方法。它以酶作为标记物，与抗体（或抗原，抗抗体）联结，形成酶标抗体（抗原，抗抗体），其与相应的抗原（或抗体）作用后，通过底物的颜色反应进行抗原（抗体）的定性和定量（酶标测定仪），亦可用于组织中抗原或抗体的定位研究，即酶免疫组织化学技术。目前应用最多的免疫酶技术是酶联免疫吸附实验（ELISA）。二、
2、实验原理ELISA简介1971年瑞典学者Engvall和Perlmann，荷兰学者VanWeeman和Schuurs分别报道将免疫技术发展为检测体液中微量物质的固相免疫测定方法，称为酶联免疫吸附实验（ELISA—enzyme-linkedimmunosorbentassay）ELISA基本的实验过程包被：将已知抗原或抗体通过物理吸附到固相载体表面，使抗原或抗体固相化。抗原抗体反应：先后加入被检标本和酶结合物，使之与固相抗原或抗体发生免疫反应而被结合固定。酶促反应：在反应体系中加入酶作用的底物，使发生酶促反应而显色。ELISA：根
3、据检测目的和操作步骤不向，有以下三种类型的常用方法。酶联免疫吸附实验间接法双抗夹心法竟争法双抗体夹心法双抗原夹心法(1)包被固相抗体（室温放置，厂家完成）(2)加入待检样品（抗原）抗体抗原ELISA检测—双抗体夹心法（测抗原）放大的反应小孔酶标抗体(4)加入酶反应底物后显色（HRP酶与底物反应后,显兰色）底物(3)加入酶标抗体试剂（夹心饼干形成!）ELISA检测—双抗体夹心法（测抗原）ELISA检测—双抗原夹心法（测抗体）与双抗体夹心法区别：（1）包被抗原（2）检测样品待测抗体，如血清等。（3）酶标抗原酶标板酶标仪三、实验内容1
4、.采用双抗原夹心法,测定乙型肝炎表面抗体（HBsAb）,学习乙型肝炎表面抗体诊断试剂盒的使用方法。2.采用双抗体夹心法,测定乙型肝炎表面抗原（HBsAg）,学习乙型肝炎表面抗原诊断试剂盒的使用方法。1．乙肝病毒表面抗体(HBsAb)诊断试剂盒。预包被微孔条（包被纯化HBsAg）酶结合物：辣根过氧化物酶标记HBsAg（HBsAg-HRP）抗HBs阳性对照抗HBs阴性对照洗涤液(浓缩液，用前以蒸馏水稀释，按说明)底物A（H2O2）、底物B（四甲基联苯胺）和终止液（HCl及2mol/LH2SO4）。四、实验材料2．乙肝病毒表
5、面抗原(HBsAg)诊断试剂盒。预包被微孔条（包被纯化HBsAb）酶结合物：辣根过氧化物酶标记HBsAb（HBsAb-HRP）HBsAg阳性对照血清HBsAg阴性对照血清洗涤液(浓缩液，用前以蒸馏水稀，按说明)底物A、B和终止液。3．微量加样器，吸水纸等。四、实验材料1.待检测样品待测血清4种：1号、2号、3号、4号注意：待测血清是从医院采集的正常血清(人为加进去乙肝表面抗原或者抗体)，但是并不表示血清中不含有可传染的疾病，所以实验中要注意安全。五、实验步骤2.分组：每4人一组，每组有检测HBsAg和检测抗体（抗－HBsAg）的
6、2种试剂盒。反应条各1条,每条含6个反应孔。1个孔做阳性对照，1个孔阴性对照，4个做样品检测。本实验空白对照孔不设。五、实验步骤3.检测方法（1）加样：每孔加待检血清50ul,每次实验各做1个阴性对照和阳性对照。注意：每位同学选择一种待测血清进行检测（见下图）。五、实验步骤阴性阳性待检血清1号,2号,3号，4号……….对照对照1号同学取待测血清1号阴性阳性待检血清1号,2号,3号，4号………….对照对照1号同学取待测血清1号2号同学取待测血清2号2号同学取待测血清2号（1）加样：其他按说明书操作！各50ul血清(2)每孔加1滴酶
7、结合物,充分混匀，37℃孵育30min。(3)甩弃孔内液体（在水池中甩弃，不要在实验室中随地甩弃）；(4)每孔加满洗涤液,静置1min,甩干。同上洗涤重复4次，拍干。五、实验步骤(5)每孔加显色液A,B各1滴,充分混匀，置37℃15min（水浴锅的盖子上面水擦干净）。按以下方法,进行肉眼观察结果:阴性对照孔无色,阳性对照孔蓝色;待测孔显蓝色,为阳性,否则为阴性。（记录颜色！）(6)加终止液：各孔加终止液1滴，反应条取出，放入消毒缸。五、实验步骤4.实验结果及结论五、实验步骤阴性对照孔阳性对照孔待测1待测2待测3待测4结果结论5.
8、作业：按实验报告要求写出并上交实验报告。HBV属于嗜肝DNA病毒科，是乙型肝炎的病原体。在中国，HBV感染或携带者已超过1.3亿，发病人数超过3000万人。HBV基因组为双链环状DNA，其中有一个单链区。HBV的抗原组成由表面抗原（HBsAg）、核心抗原(HBc
