鼠伤寒沙门氏菌回复突变实验

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1、实验二鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验（5009.9-2003食品中淀粉的测定）一、目的与要求：1、了解化学毒物致突变性分析的原理及分析要求。2、掌握回复突变的测试方法。二、实验原理鼠伤寒沙门氏组氨酸营养缺陷型菌株不能合成组氨酸，故在缺乏组氨酸的培养基上，仅少数自发回复突变的细菌生长。假如有致突变物存在，则营养缺陷型的细菌回复突变成原养型，因而能生长形成菌落，据此判断受试物是否为致突变物。某些致突变物需要代谢活化后才能引起回复突变，故需加入经诱导剂诱导的大鼠肝制备的S9混合液。三、培养基和试剂1、0.5mmol/L组氨酸-0.5mmol/L生物素溶液成分：L-组氨酸(MW155)7

2、8mgD-生物素(MW244)122mg加蒸馏水至1000ml配制：将上述成分加热，以溶解生物素，然后在0.068MPa下高压灭菌20min。贮于4℃冰箱。2、顶层琼脂培养基成分：琼脂粉1.2g氯化钠1.0g加蒸馏水至200ml配制：上述成分混合后，于0.103MPa下高压灭菌30min。实验时，加入0.5mmol/L组氨酸—0.5mmol/L生物素溶液20mL。碘溶液：称取3.6克碘化钾溶于20毫升水中，加入1.3克碘，溶解后加水稀释至100毫升。3、Vogel-Bonner(V-B)培养基E成分：枸椽酸(C6H8O7·H2O)100g磷酸氢二钾(K2HPO4)500g磷酸

3、氢铵钠(NaNH4HPO4·4H2O)175g硫酸镁(MgSO4·7H2O)10g加蒸馏水至1000ml配制：先将前三种成分加热溶解后，再将溶解的硫酸镁缓缓倒入容量瓶中，加蒸馏水至1000mL。于0.103MPa下高压灭菌30min。储于4℃冰箱。4、20%葡萄糖溶液成分：葡萄糖200g加蒸馏水至1000ml配制：加少量蒸馏水加温溶解葡萄糖，再加蒸馏水至1000mL。于0.068MPa下高压灭菌20min。储于4℃冰箱。5、底层琼脂培养基成分：琼脂粉7.5g蒸馏水480mlV-B培养基E10ml20%葡萄糖溶液10ml配制：首先将前两种成分于0.103MPa下高压灭菌30mi

4、n后，再加入后两种成分，充分混匀倒底层平板。按每皿25mL制备平板，冷凝固化后倒置于37℃培养箱中24h，备用。6、营养肉汤培养基成分：牛肉膏2.5g胰胨5.0g磷酸氢二钾(K2HPO4)1.0g加蒸馏水至500mL配制：将上述成分混合后，于0.103MPa下高压灭菌30min。储于4℃冰箱。7、盐溶液(1.65mol/LKCl+0.4mol/LMgCl2)成分：氯化钾(KCl)61.5g氯化镁(MgCl2·6H2O)40.7g加蒸馏水至500ml配制：在水中溶解上述成分后，于0.103MPa下高压灭菌30min。储于4℃冰箱。8、0.2mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.4)成

5、分：磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H2O)2.965g磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)29.015g加蒸馏水至500ml配制：溶解上述成分后，于0.103MPa下高压灭菌30min。储于4℃冰箱。9、S9混合液成分：每毫升S9混合液肝S9100ml盐溶液20ml灭菌蒸馏水380ml0.2mol/L磷酸盐缓冲液500ml辅酶II(NADP)4mmol6-磷酸葡萄糖(G-6-P)5mmol配制：将辅酶II和6-磷酸葡萄糖置于灭菌三角瓶内称重，然后按上述相反的次序加入各种成分，使肝S9加到已有缓冲液的溶液中。该混合液必须临用现配，并保存于冰水浴中。实验结束，剩余S9混合液应

6、该丢弃。10、大鼠肝微粒体酶的诱导和S9的制备诱导：最广泛应用的大鼠肝微粒体酶的诱导剂是多氯联苯（PCB混合物），选择健康雄性大鼠体重200g左右，一次腹腔注射诱导剂，剂量为500mg/kg体重。诱导剂溶于玉米油中，浓度为200mg/mL。苯巴比妥钠和β-萘黄酮结合也可做为诱导剂。S9制备：动物诱导后第五日断头处死。处死前12h停止饮食，但可自由饮水。首先，用75%酒精消毒动物皮毛，剖开腹部。在无菌条件下，取出肝脏，去除肝脏的结缔组织，用冰浴的0.15mol/L氯化钾溶液淋洗肝脏，放入盛有0.15mol/L氯化钾溶液的烧杯里。按每克肝脏加入0.15mol/L氯化钾溶液3mL。

7、用电动匀浆器制成肝匀浆，再在低温高速离心机上，在4℃条件下，以9000g离心10min，取其上清液（S9）分装于塑料管中。每管装2mL~3mL。储存于液氮生物容器中或-80℃冰箱中备用。上述全部操作均在冰水浴中和无菌条件下进行。制备肝S9所用一切手术器械、器皿等，均经灭菌消毒。S9制备后，其活力需经诊断性诱变剂进行鉴定。11、溶剂的选择如果受试物为水溶性，可用灭菌蒸馏水作为溶剂；如为脂溶性，应选择对试验菌株毒性低且无致突变性的有机溶剂，常用的有二甲基亚砜（DMSO）、丙酮、95%乙醇。一般操作中，为了减