専门科目（组织器官形成）

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1、平成19年度　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　医学系研究科再生医科学専攻　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　組織・器官形成専門科目（組織・器官形成）次の文章を読み、問いに答えよ。Pten(ピーテンと発音)はがん抑制遺伝子であり、遺伝性のがんを含む多くのがんにおいてその突然変異が認められる。PTENは多機能な脱リン酸化酵素であり、主要な基質はPI3キナーゼによって合成される脂質セカンドメッセンジャー分子であるフォスファチジルイノシトール-3,4,5-トリスリン酸（PIP3）である。PKBあるいはAktとも呼ばれるタンパク質リン酸化タンパクが

2、このPIP3により活性化され、標的タンパク質の一つであるアポトーシス促進作用を持つBADがリン酸化される。リン酸化されたBADはその活性が抑制される。このようなメカニズムにより、PTENはがん化の抑制に関与すると考えられる。　　　白血病や脳腫瘍など多くのガン細胞は、体の各組織に存在する組織幹細胞に性質の類似したガン幹細胞に由来すると考えられている。ガン治療ではガン細胞のみを可能な限り選択的に排除し、各組織の維持に必要な組織幹細胞は、なるべく正常に維持することが求められる。もしPTENの機能をガン細胞とそれが由来したと考えられる組織幹細胞の間で比較し、差異を見つけることができれば、有効

3、なガン治療に繋がると期待される。そのために、ガン幹細胞に由来することが知られている急性骨髄球性白血病を対象にマウスで実験を行った。まず、Ptenを欠失させるためにマウスのPtenゲノムに図１のような突然変異を導入した。①　Pten遺伝子を表す実線部分の矢頭（　　）はloxPというバクテリア遺伝子の一部に由来する配列であり、Ptenの機能に重要なエキソン４および５を挟み込む（flank）ように配置されている(従ってこのような操作を行った領域はflankedbyloxP7　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　平成19年度　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　

4、　　　　　医学系研究科再生医科学専攻　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　組織・器官形成、短縮してfloxと表記される)。このようなPtenfloxアレルは、P1ファージのコードするloxP配列特異的組み換え酵素Creを作用させると、DNA分子内で相同組み替えが起こり、PtenΔアレルへと変換される。血液細胞特異的に遺伝子発現を誘導するMx-1転写調節領域とCreを接続したDNAコンストラクトを導入したマウス（Mx-1-Cre）を別に作製しておき、Ptenfloxマウスと交配させた二重突然変異マウスPtenflox;Mx-1-Cre②では、血液細胞でのみPtenΔ

5、アレルが誘導されることになる。このような条件的Pten機能破壊マウスにポリイノシン-ポリシチジン（pIpC）を投与すると、インターフェロン応答配列であるMx-1が血液細胞で活性化され、ほとんどの血液細胞がPtenΔアレルのホモ接合体になる。pIpC投与後５日にはPtenflox/flox;Mx-1-Creマウスの脾臓の細胞数は10倍以上に増加し、６週には未分化骨髄球あるいは急性骨髄球性白血病のマーカーであるクロロアセテートエステラーゼ陽性細胞が全細胞の20％程度観察された。つまり、Ptenを欠損させると、白血病になる直前の状態に陥ると考えられる。この時、骨髄の全細胞数には変化が見られ

6、なかったが、数の少ない（およそ0.1％）血液幹細胞の動態を知るために、pIpC投与後５日および24-39日目にPtenflox/flox;Mx-1-Creマウスの骨髄細胞を採取し直接Flk-2陰性Sca-1陽性Lin陰性c-Kit陽性CD48陰性という指標を用いて血液幹細胞（HSCs）の数を調べた（図２）。　　　PI3キナーゼのシグナル経路の下流にはmTORキナーゼがあり、AMLの治療薬であるラパマイシンによってその活性は阻害されることが知られている。そこで、pIpC7　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　平成19年度　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　

7、　　　　　　医学系研究科再生医科学専攻　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　組織・器官形成投与によって白血病を誘導したPtenflox/flox;Mx-1-Creマウスに対するラパマイシンの影響を調べることにした。pIpC投与後４週間で図３のように虚脱、毛の逆立ち、脊椎湾曲などの白血病特有の症状が認められ安楽死が必要であったが、毎日4mg/Kgのラパマイシンを投与したものは全て健康であった。このとき、脾臓の全細胞数はラパマイシン投与マウ