《生物技术实践》识记内容

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1、技术资料《生物技术实践》讲义实验1大肠杆菌的培养和分离以及分离以尿素为氮源的微生物知识要点： ▲微生物是指结构简单、形体微小的单细胞、多细胞或没有细胞结构的低等生物，包括病毒、原核生物、原生生物和某些真菌。细菌是单细胞的原核生物，有细胞壁（肽聚糖）、细胞膜、细胞质，无成型的细胞核，只有一环状DNA分子（拟核）。以分裂（二分裂）的方式繁殖，分裂速度很快。用革兰氏染色法将细菌分为革兰氏阳性菌（革兰氏染液染色后，再脱色液处理，细菌仍保留染色液的颜色）和革兰氏阴性菌两大类，区别在细胞壁的成分不同。大肠杆菌是革兰氏阴性、兼性厌

2、氧的肠道杆菌，在肠道中一般对人无害，但也有一些菌株对人体是有害的，可以侵袭肠黏膜并产生毒素。但是，任何大肠杆菌如果进入人的泌尿系统，都会对人体产生危害。▲细菌的分离方法有两种：划线分离法和涂布分离法。是消除污染杂菌的通用方法，也是用于筛选高表达量菌株的最简便方法之一。划线分离就是用接种环蘸菌液后在含有固体培养基的培养皿平板上划线，在划线的过程中菌液逐渐减少，细菌也逐渐减少。划线最后，可使细菌间的距离加大。将接种后的固体培养基培养10～20小时后，一个细菌细胞就会繁殖成许多细菌细胞，这些细胞紧紧聚集在一起，形成菌落，不

3、会重叠。在斜面上划线，则每个斜面的菌群就是由一个细菌产生的后代。用于基因工程的大肠杆菌的工程菌，可以用划线分离法获得产物表达能力高的菌株。由于工程菌的质粒中通常有抗性基因（如抗氨苄青霉素基因），如在培养基中加入一定量的氨苄青霉素，由于非工程菌的其他杂菌都没有抗性基因，所以在划线后只有存在抗性基因的工程菌能生存下来。 涂布分离时，需要先将培养的菌液稀释，通常稀释10-5～10-7倍，然后取0.1ml稀释度不同的菌液放在培养皿的固体培养基上，用玻璃刮刀涂布在培养基平面上进行培养，在适当的稀释度下，可培养得到相互分开的菌落

4、。通常每个培养皿中有20个以内的单菌落为最合适。将每个菌落分别接种在斜面上扩增培养后，再做功能性实验。划线分离法，方法简单；涂布分离法，单菌落更易分开，但操作复杂。 ▲在培养微生物时，必须进行无菌操作。其首要条件是各种器皿必须是无菌的知识共享技术资料，如各种大小的培养皿、试管、三角瓶、取样器的头（或称“枪头”）、称液管、三角刮刀、接种环、镊子等等。这些用具通常用高压蒸汽灭菌法灭菌。各种培养基也必须是无菌的，转移培养基、倒平板、接种、平板划线、平板稀释涂布等操作中的每一步都要做到无菌，必须在酒精灯火焰旁操作（防止杂菌污

5、染）。培养基在121℃（1kg/cm2压力）下，灭菌15min。值得注意的是，实验中所需的棉花不能用脱脂棉，因脱脂棉易吸水，吸水后容易引起污染。灭菌后，通常将实验用具放入60～80℃的烘箱中烘干，以除去灭菌时的水分。如果培养基中有葡萄糖，为防止葡萄糖分解碳化，要用500g/cm2压力（90℃以上）灭菌30min。有些不能加热灭菌的化合物，如尿素（加热会分解），只能用G6玻璃砂漏斗过滤，但玻璃砂漏斗使用前也要在121℃下用纸包好灭菌。玻璃砂漏斗用后需用1mol/L的HCl浸泡，并抽滤去酸，再用蒸馏水洗至洗出液呈中性，干

6、燥后保存。进行恒温培养时，要将培养皿倒置，是因为培养基中的水分会以水蒸气的形式蒸发，不倒放培养皿会使水蒸气凝结成水滴后，落入培养基的表面并且扩散，菌落中的细菌也会随水扩散，菌落间相互影响，很难在分成单菌落，达不到分离的目的。 细菌扩大培养要用LB液体培养基（通用培养基、常用于做生理学研究和发酵工业），划线分离要用LB固体培养基（常用于微生物分离、鉴定、计数和菌种保存）。“细菌喜荤，霉菌喜素”，通常细菌培养基要用蛋白胨和酵母提取物来配制，还要加入一定的氯化钠，以维持一定的渗透压；霉菌培养基一般用无机物配制或添加蔗糖的豆

7、芽汁即可。尽管培养基的配方各不相同，但其基本成分都一样。　在无菌操作下将单菌落用接种环取出，再用划线法接种在斜面上，37℃培养24h后，置于4℃冰箱中保存。问题：1．微生物、细菌与大肠杆菌之间有怎样的关系？2．培养大肠杆菌的LB培养基中有各种物质，为什么选择这些物质，这些物质有什么作用呢？　知识共享技术资料人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出了供其生长繁殖的营养基质——培养基。虽然各种培养基的具体配方不同，但一般都含有五大营养要素，即水、无机盐、碳源(提供碳元素)、氮源(提供氮元素)和生长因子(不同的细菌需要的

8、各不相同，有物种差异，它主要补充自身不能合成的或合成能力较弱的，但却是生长繁殖必需的物质)。无机盐作用：维持渗透压、pH等3．该实验中这些操作的原因　⑴将大肠杆菌用接种环自斜面转移到液体培养基中培养时，为什么接种环必须先深入到斜面冷却后，才能再取斜面上的菌体？　　接种环在取菌体前曾在酒精灯火焰上灼烧灭菌，一直灼烧至红，温度很高，若不冷却就直接用