基因功能研究的新技术课件_1

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1、RNAi：基因功能研究的新技术RNAi：基因功能研究的新技术RNAi的定义RNAi的发现和研究历程RNAi的作用机制和特征RNAi的生物学功能和意义RNAi的应用展望与思考RNAi的定义RNAi(RNAinterference)Sequence-specific,post-transcriptionalgenesilencingmediated(PTGS)bydouble-strandedRNARNA干涉是指双链RNA引起的序列特异性的转录后基因沉默RNAi广泛存在于从真菌到植物，从无脊椎动物到哺乳动物的多种生物

2、体中，是一种自然存在的生物学现象。目前，RNAi已发展成为一种新的分子生物学实验技术，用于特异性地降低或关闭某些基因的表达。RNAi的发现和研究历程(JorgensenR,1990)1995年，Guo等在试图阻断线虫（C.elegans）中的par-1基因时，惊讶地发现给线虫注射正义RNA（senseRNA）同反义RNA一样，能特异性地抑制线虫par-1基因的表达，而未出现预期的正义RNA使基因表达增强的现象。这与传统上对反义RNA技术的解释正好相反，他们一直没能给这个意想不到的结果作出合理解释。经过纯化的dsRNA却

3、能够高效特异地阻断相应基因的表达，他们将这一现象称为RNAinterference。FireA,etal.随后，dsRNA介导的RNAi现象陆续发现于真菌、果蝇、拟南芥、锥虫、水螅、涡虫、斑马鱼等几乎所有真核生物中。这说明RNAi机制很可能是在进化的早期阶段就已经产生了。1999年，Hamilton等在基因诱导的PTGS植株和病毒诱导的PTGS植株中，首次发现了长度为25nt的RNA中间产物。2000年，Zamore和Hammond等在研究中发现，RNAi实验中加入的dsRNA被首先降解成21-23nt的小片段RNA（

4、smallinterferingRNA，siRNA），随后在siRNA的引导下，由核酸内切酶将同源mRNA降解。这一发现首次显示了dsRNA介导的基因沉默是一个同源依赖的两步降解反应。2000年，Wianny和Svoboda等分别发现，在小鼠的早期胚胎和卵母细胞中dsRNA也能产生特异性的RNAi效应。表明dsRNA在哺乳动物中也能诱导产生特异性的基因沉默，这为利用RNAi研究人类基因功能和基因治疗提供了崭新希望。然而，对哺乳动物细胞而言，较长dsRNA诱导的RNAi作用不象它在其它真核生物中那样高效特异。因为较长的d

5、sRNA（长度大于30nt）的导入可能与病毒侵入细胞相似，在哺乳动物细胞中可诱发细胞内I型干扰素（IFN-α，IFN-），导致非特异性地降解mRNA，致使基因表达减少甚至细胞凋亡。令人振奋的是，在2001年ElbashirSM等克服了这一障碍，找到了一种在哺乳动物细胞中关闭特定基因的新方法，他们用合成的21nt的siRNA(smallinterferingRNA)，成功地抑制了不同哺乳动物细胞（人胚肾293细胞、HeLa细胞）中的靶基因的表达，同时避免了对其他蛋白质合成的抑制。从此RNAi研究得以迅猛发展。用RNAi

6、作关键词，在PubMed网上可以检索到600多篇文章Cell14篇Nature10篇Science13篇BREAKTHROUGHOFTHEYEAR:SmallRNAsMakeBigSplash#1TheWinnerRNAiastool-companiesRNAi的作用机制和特征Science2002296:1263RNAi的作用特征RNAi具有高度的特异性。dsRNA能够非常特异地诱导与之序列同源的的mRNA降解，而无关基因不受影响。RNAi具有高效性。相对很少量的dsRNA分子（数量远远少于内源mRNA的数量）就能

7、产生强烈的RNAi效应，产生类似基因“剔除”的效果。RNAi存在放大效应。通过线虫、果蝇和小鼠的实验研究发现，少量的dsRNA能够使大量的靶基因沉默，即便细胞增殖50-100倍仍可保持RNAi效应，这表明RNAi存在扩增机制。RNAi作用广泛并可遗传。dsRNA介导RNAi不仅在导入部位产生抑制效应，而且可以跨越细胞界限在不同细胞间长距离传递和维持。在线虫，果蝇等RNAi效应可以在生物体内传播，并可传给子代。通过RNA依赖的RNA聚合酶（RdRP)合成dsRNA。己知的植物病毒基因组90％以上都是ssRNA，需要依靠病

8、毒自身的RdRP进行复制。此外，异常的ssRNA（"aberrant"ssRNA）也可经RdRP合成dsRNA。转座元件产生dsRNA。转座元件（TE）是基因组中基因座位可以移动的DNA序列。TE有2类：I型TE是返转座元件，其通过RNA的逆转录进行扩增。I型TE是植物TE中最主要的类型。II型TE所有生物都有，以原核生物居多。人