单分子测序助力医学研究.

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1、[键入文字]单分子测序助力脆性X综合征的研究[创新技巧]美国加州大学戴维斯分校（UCDavis）医学院及PacificBiosciences公司的研究人员利用单分子实时测序技术，对脆性X综合征的关键基因FMR1中的CGG片段扩增进行了测序。他们在第15届脆性X和早发性认知缺损国际研讨会上公布了他们的研究成果。脆性X综合征（又称Martin-Bell综合征）是一种遗传性综合征。它导致一系列特征性症状，包括生理、智力、情绪、以及行为上的异常。症状的轻重各有不同。该疾病伴随着X染色体上一段三核苷酸序列（CGG）的扩增。这种扩增导致了一种称为F

2、MR1的蛋白质无法在病人体内表达，而该蛋白质是神经正常发育所必需的。脆性X智力低下（FMR1）基因位于X染色体上，其5’非翻译区（5’UTR）包含了CGG三核苷酸的重复序列。大部分人的CGG片段重复5-44次。CGG片段的扩增与认知力和生殖功能受损相关。如果一个人含有45-54个重复序列，则被认为是“灰色地带”，而55-200个重复序列被称为前突变，200个以上重复序列则被称为全突变。生物通www.ebiotrade.com中度CGG重复序列扩增（55-200个CGG重复）可导致脆性X相关性震颤/共济失调综合征（FXTAS），一种以意向

3、性震颤、步态共济失调和其他症状为特征的迟发性神经变性疾病1。而高度CGG重复序列扩增（>200个CGG重复）可引起转录沉默和FMR1编码蛋白（FMRP）的功能丧失，从而导致脆性X染色体综合征1。[键入文字]由于目前的测序方法都依赖于大量相同拷贝的读取，因而大量扩增的CGG重复（>100）只能生成不连贯的信号（图1）。这阻碍了研究人员获得单碱基分辨率的测序数据。图1：随着重复扩增数量的增多，生成大量相同的拷贝变得越来越困难。这阻碍了对大部分疾病范围(>100次重复)内重复扩增序列的准确测序。于是，研究人员利用PacificBioscien

4、ces公司的单分子实时（SMRT）测序技术，试图从大量扩增的CGG重复序列中产生高质量的测序数据（图2）。他们首先利用PCR从人类基因组DNA中扩增出带不同CGG重复的FMR1序列，制备出待测文库。随后加上发夹测序接头，生成闭合的环状测序模板。之后利用PacificBiosciencesRS对样品进行测序。最后采用BLASR算法将长读取装配成环状共有序列（CCS），而目标序列的覆盖度至少为3倍。[键入文字]结果表明，环状共有序列的读取产生了生理相关范围的重复扩增。而对长的重复等位基因的测序能力似乎仅受读长限制。原始读长超过10kb，使得

5、环状共有序列覆盖了超过750个CGG重复片段。图3：一段CGG重复片段范围内的环状共有序列读取图。接近155个重复的峰是SMRTcell被动上样偏向（passiveloadingbias）与较小插入片段优势的综合结果。示例：环状共有序列读取包含372个CGG重复。研究人员认为，通过这种方法，如今能够以单碱基分辨率完整鉴定所有与疾病相关的等位基因，从而有利于疾病的准确诊断。参考文献1.Oostra,B.A.andR.Willemsen,FMR1:agenewiththreefaces.BiochimBiophysActa,2009.179

6、0(6):p.467-77.2.Eid,J.,etal.,Real-timeDNAsequencingfromsinglepolymerasemolecules.Science,2009.323(5910):p.133-8.Cell：单分子测序揭示惊人的基因组重排[键入文字]科学家们发现，生活在池塘里的单细胞生物Oxytrichatrifallax有一种非凡的能力，它们能在交配时将DNA打碎并快速重排这些片段。这项研究发表在上一期的Cell杂志上。Oxytricha的基因重排是一个非常精密的过程，“这是大自然早期一种的复杂化尝试，”文章

7、的资深作者，Princeton大学教授LauraLandweber说。从实用性的角度看，人们可以将Oxytricha当成模式生物，研究高等动物的染色体重排。在癌症早期，染色体会经历混乱的重排事件，而Oxytricha可以一步步地展现这一过程。这项研究中的Oxytricha基因组是通过PacBio单分子测序完成的，PacificBiosciences公司开发的这一技术可以实现超长的测序读取。Landweber介绍道，Oxytricha与其它微生物截然不同，Oxytricha细胞大约是人类细胞的十倍大，而且拥有两个细胞核。体细胞核含有5%的

8、遗传信息，有转录活性，负责调节细胞的内部活动。而生殖系细胞核保存着要传递给下一代的全部遗传信息，没有转录活性。研究显示，Oxytricha在发育过程中，能通过大规模的程序化DNA重排，将生殖系细胞核转变为体