组织胞浆菌病课件

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1、南方医科大学珠江医院临床医学检验中心暨临床免疫研究中心实验室胡冬梅2009年3月10日抗细胞表面组蛋白样蛋白抗体在荚膜组织孢浆菌病中保护性作用的研究Antibodiestoacellsurfacehistone-likeproteinprotectagainstHistoplasmacapsulatumGeneralconditionofthePaperTitle：Antibodiestoacellsurfacehistone-likeproteinprotectagainstHistoplasmacapsulatum.Aut

2、hor：NosanchukJD,SteenbergenJN,ShiL,DeepeGSJr,CasadevallA.Periodical：JClinInvest.Data：2003,112(8);1164-75SCIIndex：16.915CultureofHistoplasmacapsulatumContent结论：Conclusion背景：Background思路：Thread结果：Result方法：MethodBackground1.荚膜组织孢浆菌（Histoplasmacapsulatum，Hc）是真菌呼吸道疾病的最主要

3、的原因；2.免疫缺陷患者的发病率高，病情严重，死亡率高；3.抗真菌治疗效果有限；4.目前的共识：体液免疫在宿主抵抗HC中的作用有限或缺如；5.研究的假设：单克隆抗体具有抗HC的作用。HistoplasmacapsulatumThread单抗针对性抗原的产生与鉴定单抗特性及功能单抗的位点分析单抗的传代和鉴定钓蛋白-测序-DNA-抗原CFU、荧光、吞噬、存活研究免疫荧光试验、免疫金电镜杂交瘤技术研究的思路Method一.杂交瘤技术制备HC单克隆抗体HCATCCG217B和HCCIB1980抗体检测用重链恒定区和κ、λ轻链特异性的碱

4、性磷酸酶结合的抗体鉴定每种单抗的重链和轻链同种型HC酵母细胞培养、灭活多次免疫BALB/c小鼠ELISA测抗体滴度抗体滴度为1：12800的用于杂交瘤的细胞融合试验mAbMethodyeastInfectedtissuestrain二、单抗在HC酵母上位点的研究G217B和CIB1980+单抗/对照单抗+GAMFITC-IgM免疫荧光检查Hc酵母经鼻感染BALB/c小鼠14天后处死取肺脏免疫荧光检查HC菌株G217B+单抗/小鼠多抗IgM+GAMIgM-5nm金电镜其它真菌一起检查阴性对照Methods对于抗体自身的研究抗体特

5、异性的研究单抗纯化生物素化竞争性ELISA试验抗体功能的测定体外实验:体内试验因子测定备注：单抗：9C7,5B8,3B9对照单抗：5C11琼脂糖小球结合的GAMIgMEZ-LinkSulfo-NHS-Biotin试剂盒单抗对小鼠生存时间的观察；单抗+两性霉素B对小鼠生存时间观察单抗功能测定Methods1.单抗对HC的直接效应；2.单抗对HC的调理素样作用对真菌的穿透性研究；3.CFU的测定和小鼠生存情况的研究：4.细胞因子和趋化因子的测定：5.吞噬作用分析：6.巨噬细胞内酵母生长情况分析：CFU测定小鼠肺组织的组织学检查；小

6、鼠肺、肝、脾的CFU测定；小鼠生存时间的测定：巨噬细胞吞噬荧光素标记的HC；HC表面受体的研究:受体抗体、受体转染CHO细胞巨噬细胞内被吞噬的HC测定：3H亮氨酸Methods1.单抗对HC的直接效应F-12培养基HC酵母细胞培养、等分、计数HC单抗脑心浸液琼脂脑心浸液琼脂cfu测定F-12培养基F-12培养基对照单抗显微镜观察Methods2.单抗对HC调理素作用穿透真菌的研究HCHCHC单抗对照单抗PBSHC:5×106离心上清液ThioGlo1SDS/±离心上清液离心上清液OD：405nm和535nm荧光测定注：1.Th

7、ioGlo1：硫醇特异性荧光团；2.经透化处理的抗生物肽二甲双胍为阳性对照37°C中孵育15分钟ThioGlo1SDS/±ThioGlo1SDS/±Methods3.CFU测定和存活研究单抗对照单抗PBSBALB/c或C57BL/6小鼠5×106HC酵母经鼻感染14天后处死福尔马林固定组织学检查BHI琼脂CFU测定单抗对照单抗PBS12.5×107HC酵母经鼻感染两性霉素B观察生存时间2h后一天2次观察生存情况(亚抑制剂量)Methods4.细胞因子和趋化因子的测定5×106HC菌株G217感染小鼠C57BL/6小鼠给予9C7

8、或PBSPBS假感染小鼠蛋白酶抑制剂第2、7天第2、7天匀浆离心上清液IL-2IL-4IL-6IL-10IL-12p70单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）TNF-αIFN-γ2小时后2小时后Methods5.吞噬作用分析（1）巨噬细胞样细胞J774.16HC细胞培养PBS洗涤