碱法提取质粒课件

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1、实验六碱法提取质粒转到目录目录返回标题一．目的二．原理附：原理示意图三．试剂四．器材五．注意事项六．操作步骤1六．操作步骤2六．操作步骤3GFPuv质粒的信息图片GFPuvvector’sDescriptionLocationoffeatures1Locationoffeatures2Locationoffeatures3Locationoffeatures4Vector’sPrimerLocationPropagationinE.coli一．目的了解提取质粒的原理。学习和掌握质粒提取的方法和技术。——三个基本步骤：细菌的生长和质粒的扩增菌体的收集裂解及质粒DNA的分离质粒DNA的纯化

2、返回目录返回目录二．原理质粒是细菌内的共生型遗传因子，它能在细菌中垂直遗传并且赋予宿主细胞一些表型。质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或表达的重要媒介，这种基因的运载工具在基因工程中具有极广泛的应用价值，而质粒的分离与提取则是最常用、最基体的实验技术。质粒的提取是利用质粒DNA与染色体DNA分子大小不同和性质的差异性进行的。染色体DNA比质粒DNA大得多，且是线状分子易断，经加热或碱处理后容易变性并产生沉淀，即使冷却或碱性被中和后也不可能复性，与变性蛋白质及细胞碎片一起沉淀析出。质粒DNA是共价结合的环状分子，不会因加热或碱处理等被折开，加热冷却或恢复中性PH后又呈天然构型，溶解在溶液中

3、。这样通过加热或碱处理后又中和PH，再用离心的方法就可把质粒DNA提取出来。☆原理示意图返回目录☆原理示意图返回目录返回原理三．试剂1.LB培养基detail2.STEdetail3.溶液Idetail4.溶液Ⅱdetail5.溶液IIIdetail6.3M乙酸钠(pH5.2)detail7.TE(pH8.0)detail返回目录LB培养基back配制1升培养基，应在950ml去离子水中加入：细菌培养基用胰化蛋白胨(bacto-tryptone)10g细菌培养基用酵母提取物(bacto-yeastextract)5gNaCl10g摇动容器直至溶质完全溶解，5mol/LNaOH(约0.2

4、ml)调节pH值至7.0,加入去离子水至总体积为1L，15lbf/in2(1.034×105Pa)高压下蒸汽灭菌20分钟。STEback0.1mol/LNaCl10mmol/LTris·Cl(pH8.0)1mmol/LEDTA(pH8.0)在15lbf/in2(1.034×105Pa)高压下蒸汽灭菌20分钟。溶液Iback50mmol/L葡萄糖25mmol/LTris·Cl(pH8.0)10mmol/LEDTA(pH8.0)在10lbf/in2(6.895×104Pa)高压下蒸汽灭菌15分钟，保存于4℃。溶液IIback0.2mol/LNaOH(从5mol/L贮存液中现用稀释)1%S

5、DS溶液IIIback5mol/L乙酸钾60ml冰乙酸11.5ml水28.5ml所配成的溶液重钾的浓度为3mol/L，乙酸根的浓度为5mol/L。3M乙酸钠(pH5.2）back在800ml水中溶解408.1g三水乙酸钠，用冰乙酸调节pH值至5.2，加水定容到1L，分装后高压灭菌。0.5mol/LEDTA(pH8.0)在800ml水中加入186.1gEDTA-Na·2H2O，在磁力搅拌器上剧烈搅拌，用NaOH调节溶液的pH值至8.0(约20gNaOH颗粒)，然后定容至1L，分装后高压灭菌。1mol/LTris·Cl(pH8.0)在800ml水中加入121.1gTris-base，溶解后

6、加浓盐酸调节溶液的pH值至8.0，定容至1L，分装后高压灭菌。TE(pH8.0)back10mmol/LTris·Cl(pH8.0)1mmol/LEDTA(pH8.0)50×TAE242gTris碱57.1冰乙酸100ml0.5mol/LEDTA(pH8.0)1×TAE0.04mol/LTris-乙酸0.001mol/LEDTA(pH8.0)四．器材1.恒温摇床2.超净工作台3.离心机4.电泳仪和电泳槽5.玻璃器皿与耗材量筒、三角瓶、平皿;EP管(1.5ml,0.5ml);枪头(1ml,0.2ml,10μl);牛皮纸、纱布、牙签等返回目录五．操作步骤1挑选一个单菌落，接种到含适当抗生

7、素的3mlLB培养液中，37℃振荡培养14~16小时。取1.2ml菌液，12,000rpm离心1分钟，收集菌体。加入500μl~1mlSTEbuffer，涡旋打匀，12,000rpm离心1分钟，收集菌体。加入预冷的溶液I100μl，涡旋振荡充分悬浮，分散，混匀，冰浴5分钟(重悬细胞)。加入200μl溶液Ⅱ(现配)，快速轻柔颠倒几次，直至溶液澄清，保持冰浴(碱变性染色体DNA、蛋白质)。在5分钟内，加入溶液III150μl，轻柔颠倒5~10次，冰