煮沸法快速提取质粒

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5、】  一．实验目的：1、掌握质粒DNA分离，纯化的原理2、学习煮沸法快速提取质粒DNA的方法3、学习DNA的限制性酶切的基本技术4、学习利用琼脂糖电泳测定DNA片段的长度二、实验原理在基因工程中，DNA分子的切割是由限制性内切酶来完成的。限制性内切酶能识别特定的DNA序列，在一定的条件下切断双链DNA。限制性内切酶的作用效率是受多方面因素影响的，如反应温度，缓冲体系，离子种类与浓度，DNA的纯度和甲基化程度等。对DNA进行酶切时，首先要选择适合的缓冲液。对于单酶切，应选用该酶的最适缓冲液；对于双酶切或三酶切，应选用一种能使所有酶都充分作用的缓冲液。DNA的纯度

6、对于酶切的效果的影响也很大，因为蛋白质。酚。氯仿。SDS等杂质都会抑制限制性内切酶的活性。琼脂糖凝胶电泳是分离，鉴定和纯化DNA片段的常规方法。利用低浓度的荧光嵌入染料-溴化乙锭进行染色，可确定DNA在凝胶中的位置。如有必要，还可以从凝胶中回收DNA条带，用于各种克隆操作。琼脂糖凝胶的分辨能力要比聚丙烯酰胺凝胶低，但其分离范围较广。用各种浓度的琼脂糖凝胶可以分离长度为200bp至近50kbp的DNA。长度100kb或更大的DNA，可以通过电场方向呈周期性变化的脉冲电场凝胶电泳进行分离。在基因工程的常规操作中，琼脂糖凝胶电泳应用最为广泛。它通常采用水平电泳装置，

7、在强度和方向恒定的电场下进行电泳。DNA分子在凝胶缓冲液（一般为碱性）中带负电荷，在电场中由负极向正极迁移。DNA分子迁移的速率受分子大小，构象。电场强度和方向，碱基组成，温度和嵌入染料等因素的影响。三．实验材料和试剂：1．菌种：含pUC18的大肠杆菌JM107菌株。2．化学试剂和溶液（1）LB培养基：NaCl10g/l酵母提取物5g/l胰蛋白胨10g/l氨苄青霉素50μg/ml（培养基灭菌后加入）pH7.0（2）70%乙醇（-20℃）及无水乙醇（-20℃）（3）STET缓冲液（pH8.0）（8%蔗糖，0.5%Triton,50mmol/LEDTA,,10mm

8、ol/LTris）（4）5%CTAB（