水稻转基因方法 自己

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时间:2018-10-02

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1、转基因步骤:2-3月完成水稻幼胚愈伤组织的培养1.去壳成熟的水稻种子经70%乙醇消毒5min。2.倒去乙醇,再用2.5%次氯酸钠(每50mL加一滴吐温20)消毒15min,无菌水洗5次,再用2.5%次氯酸钠消毒15min,再用无菌水浸泡30min。3.倒去次氯酸钠,将种子倒到无菌滤纸上吸干,再将种子放在N6D(0.6%Gelrite)培养基上29.5度光照培养30-60天(白天12h29.5度,晚上12h29.5度)。注;培养基每2周换一次。农杆菌的准备1.选择有活力的愈伤组织(相对干的、淡黄色的。如图1)转到新的N6D培养基上,29.5度光照培养3天。注:褐色

2、的愈伤千万不能选,不然会影响转化效率。2.挑取含有目的基因的农杆菌单菌落或吸取所保存的农杆菌液100ul于5MLYEP培养液中(50mg/lKan+,50mg/l(利福平)Str+),28度、250rp振荡培养12-36h至OD600饱和。3.从上述菌液中吸取500ul于50mlYEP培养液中(50mg/lKan+,50mg/l(利福平)Str+).28度、250rp振荡培养12-36h至OD600=0.6-0.8。注;农杆菌培养时要避光。因为农杆菌对光敏感。农杆菌本身对利福平有抗性,质粒对Kan+有抗性,所以能在YEP培养基中(50mg/lKan+,50mg/

3、l(利福平)Str+)生长的菌斑基本上转进去质粒了,只需做下菌落PCR验证下。农杆菌的侵染1.取15ml培养好的菌液,4度,4000rpm离心10min,去上清。2.挑取农杆菌放入30mlAAM感菌液中(10-20mg/lAS),轻轻混匀使OD600=0.05-0.1。3.将愈伤放入无菌50ml离心管中。(在准备一个滤膜)4.将步骤2中农杆菌液倒入步骤3中,侵染90s,其中不停要摇晃。5.弃菌液,将愈伤组织取出置于无菌滤纸上沥干30-45min。注:这步特别重要,因为过多的农杆菌会抑制愈伤的生长6.把无菌滤纸放在2N6-AS培养基上。再把含有30ul1000*A

4、S的1mlAAM滴在无菌滤纸上,把侵染过的愈伤放在滤纸上。7.28度暗培养48-60h。抗性愈伤的筛选1.把愈伤取出,放入50ml的离心管中,加无菌水5-8次,其间不地震荡,直到水清澈为止就不用换水了。2.用含有500mg/lCar无菌水清洗2次,每次30min。3.将管中的愈伤倒在无菌滤纸上沥干1-2h。注:除去过多的水对愈伤的正常生长非常重要。4.将愈伤转到N6D-S上,每皿最多16粒。16.29.5度光照培养3-4周(图3)。17.再将愈伤转到MS-NK培养基上,长根。18.29.5度光照培养3-4周。19.将根长3-4cm的幼苗跳出,转入MS-HF培养基

5、上。20.再转移到土中培养。药品:70%酒精、1.5%次氯酸钠100*N6-vitamins:Dissolve100mgglycine(甘氨酸),25mgnicotinicacid(烟酸),25mgpyridoxinehydrochloride(盐酸吡哆醇)and50mgthiaminehydrochloride(盐酸硫胺素)thevolumeto500mlwithdistilledwater.Storeat41C.20*ABbufferDissolve60gdipotassiumhydrogenphosphate(K2HPO4)and20gsodiumdihy

6、drogenphosphatedihydrate(NaH2PO4・2H2O)in800mldistilledwater;AdjustthepHto7.2andadjustthevolumeto1literwithdistilledwaterandautoclave.Storeatroomtemperature(20–25C).20*ABsaltsDissolve20gammoniumchloride(NH4Cl),6gmagnesiumsulfateheptahydrate(MgSO4・7H2O),3gpotassiumchloride(KCl),240mgca

7、lciumchloridedihydrate(CaCl2・2H2O)and50mgiron(II)sulfateheptahydrate(FeSO4・7H2O)in800mldistilledwater;adjustthevolumeto1literwithdistilledwaterandautoclave.Storeatroomtemperature.1,000*AA-1Dissolve1gmanganese(II)sulfatepentahydrate(MnSO4・5H2O),300mgboricacid(H3BO3),200mgzincsulfatehe

8、ptahydrate(Z

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