水稻转基因方法 自己

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1、转基因步骤：2-3月完成水稻幼胚愈伤组织的培养1.去壳成熟的水稻种子经70%乙醇消毒5min。2.倒去乙醇，再用2.5%次氯酸钠（每50mL加一滴吐温20）消毒15min，无菌水洗5次，再用2.5%次氯酸钠消毒15min，再用无菌水浸泡30min。3．倒去次氯酸钠，将种子倒到无菌滤纸上吸干，再将种子放在N6D（0.6%Gelrite）培养基上29.5度光照培养30-60天（白天12h29.5度，晚上12h29.5度）。注;培养基每2周换一次。农杆菌的准备1．选择有活力的愈伤组织（相对干的、淡黄色的。如图1）转到新的N6D培养基上，29.5度

2、光照培养3天。注:褐色的愈伤千万不能选，不然会影响转化效率。2．挑取含有目的基因的农杆菌单菌落或吸取所保存的农杆菌液100ul于5MLYEP培养液中（50mg/lKan+，50mg/l（利福平）Str+），28度、250rp振荡培养12-36h至OD600饱和。3.从上述菌液中吸取500ul于50mlYEP培养液中（50mg/lKan+，50mg/l（利福平）Str+）.28度、250rp振荡培养12-36h至OD600=0.6-0.8。注;农杆菌培养时要避光。因为农杆菌对光敏感。农杆菌本身对利福平有抗性，质粒对Kan+有抗性，所以能在YE

3、P培养基中（50mg/lKan+，50mg/l（利福平）Str+）生长的菌斑基本上转进去质粒了，只需做下菌落PCR验证下。农杆菌的侵染1．取15ml培养好的菌液，4度，4000rpm离心10min，去上清。2.挑取农杆菌放入30mlAAM感菌液中（10-20mg/lAS），轻轻混匀使OD600=0.05-0.1。3．将愈伤放入无菌50ml离心管中。（在准备一个滤膜）4．将步骤2中农杆菌液倒入步骤3中，侵染90s，其中不停要摇晃。5．弃菌液，将愈伤组织取出置于无菌滤纸上沥干30-45min。注：这步特别重要，因为过多的农杆菌会抑制愈伤的生长6

4、.把无菌滤纸放在2N6-AS培养基上。再把含有30ul1000*AS的1mlAAM滴在无菌滤纸上，把侵染过的愈伤放在滤纸上。7．28度暗培养48-60h。抗性愈伤的筛选1.把愈伤取出，放入50ml的离心管中，加无菌水5-8次，其间不地震荡，直到水清澈为止就不用换水了。2.用含有500mg/lCar无菌水清洗2次，每次30min。3.将管中的愈伤倒在无菌滤纸上沥干1-2h。注:除去过多的水对愈伤的正常生长非常重要。4.将愈伤转到N6D-S上，每皿最多16粒。16.29.5度光照培养3-4周（图3）。17.再将愈伤转到MS-NK培养基上，长根。

5、18.29.5度光照培养3-4周。19.将根长3-4cm的幼苗跳出，转入MS-HF培养基上。20．再转移到土中培养。药品：70%酒精、1.5%次氯酸钠100*N6-vitamins：Dissolve100mgglycine（甘氨酸）,25mgnicotinicacid（烟酸）,25mgpyridoxinehydrochloride（盐酸吡哆醇）and50mgthiaminehydrochloride（盐酸硫胺素）thevolumeto500mlwithdistilledwater.Storeat41C.20*ABbufferDissolve

6、60gdipotassiumhydrogenphosphate（K2HPO4）and20gsodiumdihydrogenphosphatedihydrate（NaH2PO4･2H2O）in800mldistilledwater;AdjustthepHto7.2andadjustthevolumeto1literwithdistilledwaterandautoclave.Storeatroomtemperature(20–25C).20*ABsaltsDissolve20gammoniumchloride（NH4Cl）,6gmagnesi

7、umsulfateheptahydrate（MgSO4･7H2O）,3gpotassiumchloride（KCl）,240mgcalciumchloridedihydrate（CaCl2･2H2O）and50mgiron(II)sulfateheptahydrate（FeSO4･7H2O）in800mldistilledwater;adjustthevolumeto1literwithdistilledwaterandautoclave.Storeatroomtemperature.1,000*AA-1Dissolve1gmanganes

8、e(II)sulfatepentahydrate（MnSO4･5H2O）,300mgboricacid（H3BO3）,200mgzincsulfateheptahydrate（Z