国内外标记免疫分析技术研究现状

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1、国内外标记免疫分析技术研究现状国内外标记免疫分析技术研究现状2010-03-0710:06:55来源:作者:【大中小】浏览:10次评论:0条摘要：gin=0topMargin=0>　　标记免疫分析是一大类超灵敏度，高特异性检测技术的总称，因其具有许多独特优点，已广泛应用于基础医学和临床各领域。它们的基本原理相同，仅依标记物的不同而最终测量所发出的信号而异。虽然文献报告的方法已有10余种，但有推广应用价值或已被广泛应用的主要有：放射免疫分析（RIA）、酶免疫分析（EIA）、时间分辨荧光免疫分析（TRFIA）和化学发光免疫分

2、析（CLIA）等。以下仅就这四种分析技术研究现状和前景作简要介绍。　　放射免疫分析　　一、试管固相法［1］　　当前RIA发展的方向是以试管固相作为取代常规液相法的换代技术。试管固相法在抗原、抗体免疫反应完成后不必加分离剂和低温离心程序，只需测量管的放射性便可得出待测物浓度，操作简便快速，适合大量临床样品的检测。尤其以洗涤代替分离和离心，降低了非特异性结合，提高了方法精密度和准确性。　　固相抗原或抗体的包被，常规物理吸附法，所包被蛋白质的量小，均一性差，仅适合双位点夹心法。1990年Causse等［2］提出以顺丁烯二酸酐-

3、苯乙烯共聚体处理聚苯乙烯管进行活化，以共价键结合包被，提高了包被的牢固性、均一性和蛋白质的量。但因工艺流程复杂，难以推广。我们在实验研究中发现，向试管内加一种双功能基团偶联剂处理试管，类似共价键结合包被，获得满意结果。最近国外厂家已研制出氨基活化和琥珀酰亚胺酯活化，以共价键取代物理吸附，从根本上解决了固相抗体或抗原的质量问题，完全满足不同反应模式的要求。　　试管固相RIA，其反应模式也相应地进行了改进，目前应用的有下列数种。　　1.固相二抗竞争法：此模式是将二抗制成固相管作为通用分离技术，应用范围广。测定时将125I标记

4、抗原，待测样品和稀释第一抗体加至二抗固相管中温育，洗涤后测量放射性。　　2.亲和素固相竞争法：将亲和素包被制成固相管，取第一抗体生物素化。测定时取125I标记抗原，生物素化抗体和待测样品加至固相亲和素管中温育，洗涤后测放射性。此固相管不仅可以通用，且灵敏度有所提高。　　3.固相抗原竞争法［3］：本法是一种新型反应模式，适用甾体类、环核苷酸和药物等小分子化合物的检测。先将小分子半抗原经偶联剂和牛血清白蛋白结合包被试管，制成固相半抗原，经无水乙醇固定可长期保存。测定时将样品和125I标记抗体加至固相半抗原管中温育，固相半抗原

5、和待测物共同竞争性地与125I标记抗体结合，洗涤后测管的放射性。　　4.固相抗体竞争法：将抗体IgG包被制成固相抗体。测定时，将样品和125I标记抗原加至固相抗体中温育，洗涤后测管的放射性。　　二、多肽类双抗体夹心法［4］　　利用肽类分子片段抗体建立试管固相双抗体夹心法，是多肽RIA技术一大进展，提高了方法的灵敏度和特异性。例如促肾上腺皮质激素目前合成的片段已有16个，取1～13片段和18～39片段分别和蛋白结合，分别免疫兔和山羊，制备2个片段的抗体。将1～13片段抗体包被试管制成固相抗体，另将18～39片段抗体进行12

6、5I标记。测定时将样品和125I标记抗体加至固相抗体管中温育，洗涤后测放射性。本模式简便易行，更重要的是适于抗原分子上无可供125I标记的基团的一类物质。　　三、多肽或小分子蛋白片段抗体的应用　　最近的研究结果表明，利用多肽或小分子蛋白质片段和牛甲状腺球蛋白结合制备的片段抗体，可以和完整的多肽或小分子蛋白产生免疫反应，并且和125I标记的片段呈现竞争性结合反应。这一发现为应用片段抗体，建立RIA测定生物样品中活性物质提供了理论依据。例如骨钙素（BGP）是一种分子量为6000的小分子蛋白质，国外建立RIA采用从动物骨组织提

7、取抗原［5］。我们将BGP分子上人工合成的9～17氨基酸片段（Sigma产品）制备的抗体，建立了BGPRIA方法，各项技术指标达到国外同等水平。　　四、提高分析方法灵敏度的新途径　　目前发现，在生物材料中含量很低的一些活性物质，却具有重要的生物学效应，常规RIA方法难以测出。采用冻干方法不便推广，我们在实践中证实以下两种间接提高灵敏度的方法较为实用。(1)碳18硅烷微柱提取法：取血浆4ml加0.1%三氟乙酸10ml，混匀后放置10分钟，离心3500r/min，15分钟，取上清液加至预先洗涤过的微柱中。然后用蒸馏水淋洗，再

8、向柱中加75%甲醇(含0.1%三氟乙酸)3ml淋洗，流出液收集至10ml青霉素瓶中，电扇吹干，置-20℃保存，测定前加0.4mlPBS溶解。此时样品已浓缩10倍。(2)试管固相抗体捕获法：将抗体IgG稀释，取1ml加至试管中包被，制成固相试管。取待测样品1ml加至固相抗体管中，置37℃3～5小时，将样品吸出弃去，向管