标记免疫分析课件

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1、第八章体外分析技术体外分析技术是一组超微量体外分析技术的总称，它是利用某种特异性结合剂与被测物和标记物进行结合反应，从而对极微量物质进行定量分析的分析技术。1960年Berson和Yalow首次应用放射免疫分析法（RIA）测定胰岛素，开创了生物活性物质微量测定的新时代，是微量分析方法学上的一大突破。本章主要以RIA为例介绍这类方法的基本原理及方法特点。第一节放射免疫分析一、基本原理：放射免疫分析（radioimmunoassay，RIA）是体外放射分析技术中建立最早、应用最广的一类技术，其基本原理为竞争性抑制。即：放射性标记抗原和非

2、标记抗原（包括标准抗原或待测抗原）共同与特异性抗体发生可逆性结合，如图8-1。这种竞争可用以下反应式来表达：Ag+Ab→AgAb+Ag*↓Ag*Ab式中Ag*代表标记抗原，Ag代表非标记抗原，Ab代表特异性抗体，Ag*Ab代表标记抗原抗体复合物，AgAb代表非标记抗原抗体复合物。当反应体系中同时存在Ag、Ag*和Ab，而Ag*的量一定、Ab的量限定（分子数少于抗原）时，随着Ag的增加，Ag*Ab的量相应减少，即与Ag（包括标准抗原或待测抗原）的量呈负相关竞争性抑制。当反应达到平衡后，将反应体系中的标记抗原抗体复合物与游离的标记

3、抗原分离，测定其放射性。以标准抗原的浓度为横坐标，以标记抗原抗体复合物的结合率（B/T、B/F、B/B0）为纵坐标，绘制剂量效应曲线（calibrationcurve），也称标准曲线。试剂盒组成：（以T4测定为例）1、Ag(系列标准品)，浓度分别为：0、20、40、80、160、320ng/ml2、Ag*，125I-T4（红色，作为示踪剂）3、Ab，抗T4抗体（作为结合剂）4、分离剂（免疫分离剂，结合反应达到平衡后将结合部分与游离部分分开）0204080160320待1待2加样：1、Ag（系列标准品及待测样品）50ul/每管2、Ag

4、*200ul/每管3、Ab100ul/每管混匀，37℃45分钟，加分离剂离心，测定结合部分放射性。放射免疫分析的几种标准曲线图：抗原抗体的结合反应遵循质量作用定律，即：当反应达到平衡时，k1[Ag][Ab]=k2[AgAb]。设KA为平衡结合常数，也称亲和常数，则有：k1和k2分别代表结合速度常数和解离速度常数，[Ag]、[Ab]、[AgAb]分别代表游离抗原、游离抗体和抗原抗体复合物的浓度。假设Ab0和Ag0分别代表抗原、抗体的初始浓度，B和F分别代表反应平衡时结合和游离抗原的%，（以分数表示，B+F=1），可以推导出B的函数式，

5、由上式可看出是以B为函数的一元二次方程。对每一特定的RIA系统，[Ab0]和KA是固定的，[*Ag0]也是固定的，所以B在直角坐标上随非标记[Ag0]呈双曲线走向。二、基本试剂（一）、抗体（antibody）(1)、抗体的制备：抗体是体外放射分析中应用最广的结合剂，是用纯化的免疫原免疫动物制备而得，免疫的成败在于免疫原和动物种类以及注射途径、佐剂的使用、注射剂量和时间等。分子量超过5000的蛋白多肽物质具有较好的免疫原性，容易刺激高活度的抗体形成。分子量小于5000的肽类物质免疫原性低，需要与载体蛋白结合方能引起明显的抗体形成。应该

6、指出，动物对抗原的免疫反应个体差异很大，当一批动物用同样的免疫原和免疫程序进行免疫时，往往只有部分动物产生满意的反应。（2）抗血清（antiserum）的质量鉴定：评价结合剂的主要指标有滴度、特异性和亲和力。1）滴度测定：测定方法是将抗血清稀释成不同浓度，分别加入一定量的标记抗原，在适当的反应条件下达到平衡后，分离B与F，计算不同稀释度的抗血清与标记抗原的结合百分率，以结合百分率为纵坐标，以抗血清稀释度为横坐标，绘制抗血清稀释曲线（如图）。选择结合率为50%时所对应的稀释度，作为该结合剂的稀释度，该稀释度即为滴度。抗体滴度越高表明抗

7、体的质量越好。2）特异性测定：抗血清的特异性是指抗体与待测物以外的结构类似物结合的程度（又称交叉反应率）。交叉反应百分率=[Y]50/[Z]50×100%其中[Y]50为被测物结合率50%时的浓度值；[Z]50为结构类似物结合率50%时的浓度值。干扰轻者特异性高。3）亲和力和亲和常数测定：亲和力表示特定的抗原、抗体之间的结合能力，常用亲和常数KA来表示。KA越大，表示抗原、抗体之间结合能力越强，B/F值大，方法的灵敏度高。随着单克隆抗体（monoclonalantibody，McAb）技术的发展，提高了现代体外分析技术的特异性和亲和

8、力。（二）、放射性标记物放射性标记物是体外放射分析的测量依据，常用的标记核素有125I和3H。对标记物的质量要求包括：（1）比活度（specificactivity）：体外放射分析法的定量范围一般在10-9-10-12mol水平，标记