诺如病毒感染性腹泻样品采集与检测

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1、诺如病毒感染性腹泻样品采集与检测广东省疾病预防控制中心（2015年11月25日）■不同类型标本的采集要求■样品采集、运输和保藏■诺如病毒检测方法及结果分析主要内容原则不同类型标本的采样原则一、病例根据初步流行病学调查的结果，尽量采集重点病例：如首发病例/指示病例、住院病例、发病厨工、重点岗位的病例等的标本；疫情进展过程中，应选取各阶段一定比例的现症病例采集标本。一、病例发病3天内的粪便（最好）带便肛拭子或呕吐物标本一式两份（致病菌、病毒）病例数20例以下，全部采集20例及以上，至少采集20例病例标本发病超过3天的和已痊愈

2、病例可不采样保存条件及登记样本相关信息：姓名、性别、年龄，发病时间、采集时间等附件8和附表8-1二、厨工食源性暴发溯源可采集厨工的粪便（最好）或带便肛拭子标本涉疫单位的厨工人数在30人以下，全部采样；30人及以上，尽量采集接触直接入口食品岗位的厨工：如参与蛤、牡蛎、贻贝等贝壳类海产品加工，从事沙拉、凉菜、面包/糕点制作，从事餐具清洗消毒及食品分发的厨工以及近期出现过胃肠不适症状的厨工，至少采集30人。三、食品和水由于目前国家没有食品和水中诺如病毒检测的标准方法，食品和水等样本的采集和检测工作根据实际情况确定。流行病学依据

3、四、环境样品可根据疫情调查需要采集各类场所（如厨房、厕所等）的环境涂抹标本。原则样品采集、运输和保藏（附件8）一、采样对象与数量标本种类粪便（最好）带便肛拭子和呕吐物特殊情况时采集唾液用于人体易感性检测可根据疫情调查需要采集食品、水及各类场所（如厨房、厕所等）的环境涂抹样品采样数：病例数20例以下，全部采集20例及以上，至少采集20例病例标本二、采集要求粪便、带便肛拭子和呕吐物粪便可用便盒采集肛拭子用采样棉签蘸生理盐水或病毒保存液、或PBS液后，插入肛门4-5cm（幼儿2-3cm）处，轻轻旋转擦取直肠表面带便粘液，置于含

4、病毒保存液的采样管中。呕吐物可注入灭菌容器内采集的最优时间在发病后48-72小时内采集量3g/3ml左右采样时，如发现手套被污染应及时更换，采样容器外部被污染时需独立包装，以避免样品间的交叉污染。样本采集后，立即冷藏保存。唾液用灭菌平皿或广口容器留取1ml，或用棉拭子沾两颊黏膜及舌底擦拭留取。食品将残余食物用灭菌镊子或匙采取，置于灭菌容器；如无残余食物，可用干净拭子在盛放过可疑食物的容器内涂擦，然后置于装有2ml生理盐水或病毒保存液试管内。由于目前没有标准检测方法，暂时无法确定采集量，可根据病毒的最低感染限、所用方法的最

5、低检出限和可能的用量协商确定。水用干净无菌瓶采集疑似被污染的饮用水或生活用水。由于目前没有标准检测方法，暂时无法确定采集量，可根据病毒的最低感染限、所用方法的最低检出限和可能的用量协商确定。环境涂抹标本可用无菌拭子涂擦，放入病毒保存液或PBS液容器内。三、标本运送与贮存标本采集后冷藏于10℃以下立即送检，同时附样品送检表（附表8-1）。标本在采集交送过程中尽量固定、防止泄漏，如需长途运输，应放在有密封圈的螺口管中；注意防止交叉污染。如不能尽快开展检测，应贮存在-20℃冰箱短期保存。原则诺如病毒检测方法及结果分析标本处理粪

6、便流程如下图。制成10%的便悬液后，立即检测或置-20℃冰箱保存备用。注意:便悬液如果过浓，可能导致提取的核酸中抑制物过多，影响核酸检测结果。标本处理（10%便悬液制备）0.1ml/0.1g粪便标本（固体豌豆粒大小）900μlPBS漩涡振荡器剧烈震荡3次，每次15s4℃≥5000rpm离心5min或≥3000rpm离心30min室温静止10min10%便悬液上清标本处理肛拭子和环境涂抹标本经漩涡振荡器震荡15秒后，吸上清立即检测或置-20℃冰箱保存备用。呕吐物置于漩涡震荡器充分混匀，4℃,≥5000r/min离心5min

7、，或≥3000r/min离心30min，吸上清，立即检测或置-20℃冰箱保存备用。标本检测——核酸检测核酸提取（多种商业试剂，如Qiagen、罗氏等）病毒RNA提取试剂（推荐）病毒总核酸提取试剂进行PCR实验时，容易受到来自人、细菌等非目标物种基因的影响，产生假阳性。核酸提取完成后，尽快放入冰箱，如果3天内检测，10℃以下保存即可，否则放入-70℃冰箱保存。注意尽量不要让核酸被环境中、手套上的细菌、灰尘中含有的RNA酶降解，也不要反复冻融。核酸检测荧光逆转录聚合酶链反应(real-timeRT-PCR)诺如病毒核酸检测的

8、首选方法，特异性和敏感性较高，出现假阳性的机率也远低于传统RT-PCR，但受病毒核酸变异影响较RT-PCR大。目前国内商业化的试剂可检测GI和GII组病毒，但对于GⅣ组病毒的检测效果还不清楚，有些试剂的GI组检测效果也相对较差，因此如果检测结果为阴性，不能完全排除该病毒感染。核酸检测逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）