人类辅助生殖技术中的胚胎培养与筛选.doc

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1、人类辅助生殖技术中的胚胎培养与筛选作者：王冰松，袁水桥，胡淑敏，刘新宇，周玉言，孙绪磊，刘莹【关键词】辽宁沈阳，沈阳204医院生殖医学研究中心随着生殖生物学领域的不断拓展，人类辅助生殖也相应得到了飞速的发展，自世界首例体外受精-胚胎移植(IVF)婴儿诞生以来［1］，该技术已开展了约三十年。但是，尽管IVF已成为目前治疗不孕不育的完善方案，其成功率仍然较低。大部分的胚胎死亡似乎发生在移植前的培养阶段，仅有50％的体外培养胚胎能在第六天发育到囊胚阶段［2］，移植后的胚胎发育为胎儿的比例也不足15％。为了提高妊娠率，将多个胚胎一同植入时，却导致了多胎妊娠率的大幅

2、升高。因此，如何通过改善培养条件、优化配子质量和开发新的胚胎筛选技术以提高胚胎种植率一直是辅助生殖实验室研究人员所关注的焦点和努力的方向。1胚胎的体外培养在过去的十多年里，人们已经认识到通过优化培养基，可以改善IVF胚胎的体外发育和胚胎的植入率。通过降低培养基中葡萄糖的浓度、添加氨基酸和生长因子可以提高囊胚形成率和细胞数。在IVF胚胎的培养基成分改良上，已经没有多大的研究空间。据报道，即使使用无葡萄糖培养基来改进胚胎质量，妊娠率也没有升高［3］。人类胚胎在植入前的发育期间，营养需求的变化为：卵裂早期主要是对丙酮酸的需要，随着发育的进行，逐渐转变为囊胚期对丙

3、酮酸和葡萄糖都有较高的需要。受精卵在早期发育阶段从输卵管移动到子宫，发育所处的体内环境发生了变化，因而导致了胚胎营养需求的上述变化，也因此促成了囊胚阶段培养基和序贯培养基的问世［4］。随着这些新型培养基的出现，新的胚胎筛选技术也接踵而来。2胚胎的筛选2.1植入前胚胎的遗传学诊断（PGD）PGD是在胚胎植入子宫前对其进行遗传性障碍的诊断。PGD可以降低父母将遗传性疾病传给子女的风险。常规的胎儿诊断是在妊娠12~16周，通过绒毛膜绒毛样本或羊膜穿刺术对胎儿进行检查。如果胎儿有遗传缺陷，夫妻双方就要考虑终止妊娠。一种替代途径是，从IVF后的8-细胞阶段胚胎中取出

4、1～2个卵裂球，用荧光原位细胞杂交融合（FISH）或PCR对这些细胞进行分析，确定有遗传缺陷的胚胎。只有那些通过PGD检查无遗传缺陷的胚胎才能植入子宫，这样就避免了妊娠终止。第一例通过此项技术的试管婴儿出生于1990年［5］，之后通过PGD检查出生的健康孩子已超过150个。6FISH可以对处于分裂间期或中期的完整细胞核中的特殊染色体进行检查，以鉴别胚胎的性别（这对于避免X-染色体的伴性遗传疾病十分重要）和检查染色体的非整倍性(如Down氏综合征)和主要的染色体畸形(如染色体易位)［6］，而用PCR技术扩增特殊的基因序列可以对单个基因的进行检查［5］。尽管用

5、于PGD的单细胞PCR诊断具有极高的敏感性，但其精确性和可靠性仍会受到扩增失败、污染和等位基因缺失等因素的影响，所以新的PCR方法正在被不断研究评估当中。经过有效的PGD循环，大量的卵母细胞都需要回收处理，因为并不是所有的卵母细胞都会受精、卵裂，进行有效的活体检查并被确定为适于移植。自从这项技术被首次应用于临床［5］，对人类胚胎的更深入检查就显示了胚胎中细胞间的差异性是普遍存在的，包括相邻的正常细胞和异常细胞。在4日龄的人类胚胎中，约有60%的胚胎含有一个或多个双核细胞，约40%的胚胎含有染色体异常的细胞，包括单倍体、多倍体和非整倍体［7］。这种镶嵌性对P

6、GD的准确性有严重的影响，因为通过胚胎生物观察取出的那个用于分析胚胎的细胞，并不一定代表胚胎中其余细胞的状态［5］。许多研究组从8-细胞胚胎中取2个细胞进行分析，以加强诊断的可靠性，但是我们应该认识到50%以上的PGD都是用于伴性遗传疾病的诊断，并且是在性别的基础上做诊断。在这种情况下，镶嵌性不一定会导致诊断错误，因为一个胚胎只可能是男性或女性，与镶嵌性无关。总的来说，FISH使用多探针进行检测，在分析中一定能够观察到两个X标记或一个Y和一个X标记（还有一个用以确定倍性的常染色体标记），以精确诊断性别。用基因产物（mRNA）而不是基因本身进行胚胎遗传缺陷诊

7、断的可能性正在研究中。这项研究涉及开发高灵敏度的RT-PCR技术，应用于单个卵裂球中的RNA的分析。目前仅从卵母细胞胞质中取样而不是整个卵裂球中获得足够确诊胚胎缺陷的mRNA的研究有望取得成功［8］，但是，母体卵母细胞中的RNA的存留时间超过了胚胎基因组启动的时间，这可能会对诊断造成影响，而且相应的技术也尚未成熟。2.2胚胎非整倍性的筛选在妊娠第7周发生自然流产的病例中，胎儿染色体异常的发生率＞60%，显著高于同期引产胎儿的3%～9%的发生率［9］。这一发现提示，胚胎的非整倍性是导致移植失败进而使IVF成功率低的主要原因。在形态正常的人类体外发育胚胎中，2

8、0%左右患有不同程度的染色体异常，且这种异常导致了植入前胚胎的凋亡