实验室检测技术概要

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1、实验室常用检测技术简要介绍主要内容概述疾病鉴别诊断过程临床症状和大体病变检病料的采集及处理实验室检验病料中细菌的检测病料中病毒的检测一、疾病鉴别诊断过程临床标本的采集及处理原则合理的采样时机正确的采样方法适宜的采样部位一、标本采集尽量在病程的早期采集；标本应放置无菌容器中；标本应做适当的标记，如动物、地点、时间、暂定的诊断等。1唾液在生理理盐水中常加0.5%明胶或BSA，以保护不稳定病毒。2鼻、咽及肛门拭子3粪便标本4脑脊髓液、心包液、尿液等5尸体材料死后应尽早获取，无菌采取，不使用防腐剂。不同

2、病毒所取材料不同，如NDV，取脑、气管，FMV取肺、PRRS取肺、SFV取淋巴结等。二标本的保存和运送尽量活体送检，大部分病毒不稳定，必须尽快送实验室；如有延误，则标本必须冷藏，到实验室立即处理和接种，延误时间短的，可置4℃；时间延误较长，置-70℃。如邮寄标本则需放置有干冰的保温箱内。三标本处理1体液可以直接接种、检测2血标本凝固血离心后的血清即可用于检测3各种拭子4粪便标本5组织材料病原学检测常用的实验室技术分离培养（“金标准”）形态学检查（病毒电镜镜检）细菌的生化试验动物实验免疫学诊断技术

3、ELISAIFA免疫组化分子生物学诊断技术PCR荧光定量PCR二、病料中细菌的检测方法细菌的形态学检查细菌的分离培养细菌的生化试验动物试验血清学试验分子生物学方法光学显微镜下细菌的形态细菌的形态观察光镜和电镜的比较大肠杆菌葡萄球菌电镜镜检光学显微镜镜检培养结果初次分离纯培养鉴别培养不乳糖发酵乳糖麦康凯平板不发酵乳糖的细菌大肠杆菌，呈现黑色金属光泽EMB平板SS平板大肠杆菌或者别的发酵乳糖的肠杆菌有黑色中心的是沙门氏菌。如果没有黑色中心，就很可能是志贺氏菌了。不发酵乳糖的肠道菌，可能就是志贺氏菌。

4、不发酵乳糖的某种肠道菌，而且产生硫化氢，可能是沙门氏菌发酵乳糖的某种肠杆菌。HE（苏木素伊红)琼脂平板本培养基倾注平皿待冷却后呈草绿色，质控菌株接种后。36±1℃培养18—24h，观察结果。大肠杆菌部分被抑制，橙黄色-橙红色。葡萄球菌生长被抑制。革兰氏染色革兰氏阳性革兰氏阴性染色原理及过程：初染（结晶紫）媒染（碘液）脱色（95％酒精）复染（复红）细菌的生化试验硫化氢试验糖发酵试验MR试验VP试验靛基质试验药敏试验示意图青测量抑菌圈左涂布细菌贴上药敏纸片12温箱培养34以大肠杆菌为例：剖检（采集病

5、料）纤维素渗出物的涂片染色分离培养（普通营养琼脂平板、麦康凯琼脂平板或伊红美兰琼脂平板）培养物涂片G染色生化试验动物试验血清学实验玻板凝集鉴定血清型三、病料中病毒的检测电镜技术血清学试验分子生物学技术病毒的分离鉴定标本采集与送检病毒分离和鉴定的一般程序常用检测方法分离培养血清学中和试验补体结合试验血凝及血凝抑制试验免疫扩散试验免疫学诊断技术ELISAIFA免疫组化分子生物学检测PCR分子杂交技术病毒分离标本采集杀灭杂菌（青链霉素）接种鉴定病毒种型易感动物出现病状鸡胚病变或死亡细胞培养细胞病变三大

6、方法1．动物接种病毒的分离与鉴定2．鸡胚培养3．组织培养病毒中和试验本实验极为特异和敏感，是病毒学中重要的血清学实验。主要用于病毒感染的血清学诊断、病毒分离株的鉴定、不同病毒株的抗原关系研究、疫苗免疫原性的评价、免疫血清质量的评价以及实验动物中是否存在相应的抗体等。virus补体结合反应AgAb红细胞溶血素补体AbAg红细胞补体溶血素溶血（-）不溶血（+）免疫扩散电镜技术鸡痘病毒（超薄切片）狂犬病毒包涵体（Negribody）ELISA分类ELISAProcedures分子生物学方法PCR(Po

7、lymeraseChainReaction,聚合酶链反应)荧光实时定量PCR（realtimePCR）NASBA（依赖核酸序列的扩增）PCR原理:实质就是体外基因复制技术Mg2+dCTPdGTPdUTPdATPTaqDNA聚合酶AmpErasePrimer靶序列加热变性95°C靶序列引物退火55°C引物延伸72°C原理图示一二三完成一个循环30次循环后靶序列扩增的数量No.ofNo.AmpliconCyclesCopiesofTarget122438416532664201,048,576301

8、,073,741,8241cycle=2Amplicon2cycle=4Amplicon3cycle=8Amplicon4cycle=16Amplicon5cycle=32Amplicon6cycle=64Amplicon7cycle=128Amplicon荧光定量PCRTaqman技术特异性荧光双标记探针Taq酶5’→3’外切酶活性染料法的优点：成本低不需要探针；适合初步筛查先用SYBR筛查，再用TaqMan精确定量部分关键样品；融解曲线鉴定PCR有无杂带、引物二聚体；染料法的缺点：无模板特异