基因诊断技术简介

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1、基因诊断技术简介医学分子生物学的基本知识现代分子生物学的快速发展是基因诊断技术的基础。阐明疾病的分子机制是医学分子生物学的重要研究内容，包括：基因和基因组的结构和功能；细胞通讯和信号传导机制；…只有明确的了基因与疾病的关系（不易！），才能进行基因诊断。基因？基因基因：负责编码一条多肽链的所有核酸序列。编码区和调控区;DNA和RNA;外显子和内含子；STR“基因诊断”概念中的基因是广义的基因概念，病毒、细菌、人…的核酸序列及功能。什么是基因诊断？基因诊断主要是应用分子生物学技术，检测人体某些基因结构或表达的变

2、化，或者检测病原体基因组在人体的存在，从而达到诊断疾病或监控疾病的目的。以下所指基因诊断，特指遗传疾病基因诊断。基因诊断的特点直接针对治病基因进行检测，揭示疾病形成或发展的根本原因。特异性强、灵敏度高、稳定的结果、快速…….最重要的一点：还没发病，就可以预测发病！----基因型与表型。遗传病基因诊断流程需要临床医师与实验室技师的密切配合。接诊患者，遗传咨询，疾病初步诊断。详细记录病史、画家系图、记录电话地址….选用适当的基因诊断项目（尽量将现有技术用尽，追求最大的准确性）。签署基因诊断申请单，讲解基因诊断技

3、术能解决的问题，告知检测技术的风险。抽取EDTA抗凝血，提取和保存患者的DNA或者RNA。检测---报告---再次遗传咨询。遗传病基因诊断技术的复杂性基因诊断要求高准确性。(基因的结构和功能稳定，结果不准确，死得很难看!)遗传异质性。不同的疾病，不同的策略。不同的疾病具有不同的遗传学病因，诊断选用的分子生物学技术也大不相同。不同的技术各有其优缺点。技术体系完备很重要。我们的未知领域太多….技术资源有限…。基因诊断常用的技术方法PCR(polymerasechainreaction)技术:目的DNA片段的放大

4、器。PCR扩增后，可以检测目的片段的有无、结构、数量…测序技术：DNA的一级结构，ATCG的排列。主要针对突变引起的疾病。是突变检查的金标准。突变检测的技术：SSCP分析、连锁分析：酶切位点连锁分析、STR位点连锁分析、SNP、…DNARNA杂交技术：FISH（荧光原位杂交）、SouthernBlot、ASO、…STR位点常见的单基因遗传病基因诊断杜氏进行性肌营养不良（Duchennemusculardystrophy,DMD）和贝氏进行性肌营养不良（Beckermusculardystrophy，

5、BMD）SMAPKU地中海贫血临床表现杜氏进行性肌营养不良（Duchennemusculardystrophy,DMD）和贝氏进行性肌营养不良（Beckermusculardystrophy，BMD）是X连锁隐性遗传病，主要为男性发病，活产男婴发病率为1/3500。Dystrophin基因（含79个外显子）的缺失、突变、重复等均为致病原因。体检：腓肠肌假性肥大。肌电图—提示肌原性损害。血生化检查：肌酸激酶升高明显。单基因遗传病之一：DMD/BMDDMD/BMD基因分析Dystrophin基因，编码的蛋白为抗

6、肌营养不良蛋白，该蛋白缺乏或异常导致细胞膜（肌纤维）的结构和功能异常，钙内流增加，打破了细胞内钙离子平衡，导致细胞凋亡。肌肉组织中的肌酸磷酸激酶（CPK）等，由肌肉组织中逃逸至血清中，使之浓度大增。单基因遗传病之一：DMD/BMD缺失分析（直接诊断）步骤取患者外周血2mL。盐析法提取外周血中有核细胞基因组DNA。多重PCR分两组各扩增患者Dystrophin基因9个外显子（共18个外显子，分别为外显子1、3、4、6、8、12、13、17、19、43、44、45、47、48、50、51、52、60），聚丙烯酰

7、胺电泳检测产物。共18个基因位点），扩增中设置阴阳性对照及内对照。PCR扩增产物用8%聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染观察，设置100bp分子量标记判断扩增片段大小。如发现缺失，单独扩增验证。性别鉴定。绝大部分的DMD患者为男性，但是仍然有极少数女性患DMD的报告。受检者需要自己承担女性胎儿患病风险。单基因遗传病之一：DMD/BMD缺失分析（直接诊断）注意事项该技术仅仅为Dystrophin基因的常见缺失异常设计，不能检测出Dystrophin基因所有的缺失异常，也不能检测出该基因上的其它异常种类。基因缺失仅占Dy

8、strophin基因异常的大约65%-70%，18个外显子缺失分析可检出约的缺失异常约98%。所以，18个外显子没有缺失不能排除DMD诊断。该技术不能检测出其它致病基因上的异常。也不能排除由于X-射线、药物、毒物、病源微生物等其它因素导致胎儿患病的可能性。缺失热点区域：外显子45-50和外显子8附近单基因遗传病之一：DMD/BMD连锁分析（间接诊断）步骤及注意事项该技术不能直接检测出受检者的Dystrophin基