基因分析技术简介.ppt

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1、陶慧卿基因分析技术简介在生物、医学、农牧业领域的应用测序的应用基因组DNA测序cDNA测序未知序列测序已知序列再测序双脱氧链终止法的原理Sanger双脱氧链终止法的最大特点是引入了双脱氧核苷三磷酸（2ˊ,3ˊ-ddNTP）作为链终止剂。ddNTP可以在DNA聚合酶的作用下和多核苷酸链的3ˊ羟基形成磷酸二酯键，但却不能再与下一个核苷酸缩合，结果使得多核苷酸链的延伸终止。双脱氧链终止法测序的主要步骤扩增待测DNA片段，使其变性，获得单链DNA模板。选择一条与DNA单链互补的短链引物，将引物用放射性同位素标记。引物先同单链模板复性。在四个反应管中分别加入待测DNA

2、单链模板、互补引物分子、四种的dNTP、DNA聚合酶(Klenow酶)以及不同的ddNTP进行聚合反应。双脱氧链终止法测序与PCR的区别•测序只用一条引物，PCR需要两条引物•测序产物线性增长，PCR产物指数增长•测序需要dNTP和ddNTP，PCR只用dNTP•测序产物是一系列长度相差一个碱基的片段，PCR产物只有一条带1、商品化测序试剂盒-荧光染料标记ABIPRISMBigDyev3.1和v1.1试剂盒2、自动化测序仪ABIPRISM310、3100和3730全自动遗传分析仪双脱氧链终止法的发展BigDyev3.1试剂盒的反应体系及条件反应体系：单链DN

3、A模板引物DNA聚合酶Mg2+4种dNTP(dATP,dGTP,dCTP和dTTP)4种不同的荧光标记的ddNTP(ddATP,ddGTP,ddCTP和ddTTP)循环条件：96℃1min→(96℃10s→50℃5s→60℃4min)×25个循环→4℃保温ABIPrism310GeneticAnalyzercapillarySyringewithpolymersolutionAutosamplertrayOutletbuffer+Injectionelectrode-InletbufferAutosamplerTraySampleVialsElectrode

4、CapillarySeeTechnologysectionformoreinformationonCE电进样及电泳荧光激发和检测影响测序质量的因素测序成功的前提：PCR本身是成功的PCR产物一定要经过纯化后再测序测序引物比PCR引物靠后一些(Nestedprimers)在测序反应过程中反应体积不要有波动（蒸发）选择合适的测序产物纯化方法SNP筛查单核苷酸多态(SNP)是基因组中最为丰富的遗传多态，是决定个体差异的最主要的遗传基础。多态形式主要包括单碱基替代、插入或缺失，一般也包括微小片断插入/缺失。由于很多SNP位点本身就是功能多态位点，使得SNP在疾病易感

5、基因的相关性研究中有着广泛的应用。SNaPshot™MultiplexSystemSNaPshot试剂盒的反应体系及条件反应体系：单链DNA模板引物DNA聚合酶Mg2+4种不同的荧光标记的ddNTP循环条件：(96℃10sec→50℃5sec→60℃30sec)×25循环→4℃保温方法特点分型准确：该技术也称小测序技术，其准确度仅亚于直接测序。多位点同时检测：可以同时检测达12个位点，而Taqman一次仅能检测一个。不受样本量的限制:而Taqman对少量样本不适合。注意事项1．同一反应管中，不同位点的引物长度必须不同，最好能相差4-6个碱基。2．引物与模板互

6、补部分（有效引物）的Tm值至少要50℃。3．为了改变引物的长度，区分不同的位点，可以在引物的5’端加poly(dT)、poly(dA)、poly(dC)或者poly(dGACT)尾巴。这四种尾巴理论上不容易形成二级结构，并且都经过实验验证。小心：poly(dT)有可能与真核基因3’端的poly(dA)尾巴互补。4．在引物设计的时候，如果+链DNA的序列不理想，难以设计出最佳引物，请使用-链DNA设计引物。微卫星多态(STR)分析微卫卫星多态位点是一种短核苷酸串连重复多态（shorttandomrepeat,STR）,重复单元通常为2-5bp,由于这种重复序列

7、在DNA复制过程中不稳定，所以突变很高，从而导致这种标记位点的多态性很强，杂合度很高，正因为这种特点，微卫星多态在遗传分析中有着广泛的应用.荧光——引物荧光——PCR产物荧光激发与检测识别记录结果PCR电泳数据处理STR分析实验原理及步骤肿瘤和正常组织微卫星标志一致，为MSS肿瘤和正常组织微卫星标志出现缺失，为MSI-HThankyou!