基因诊断常用技术

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1、基因检测常用技术医学遗传学课程检测技术的发展1950's-RosalindFranklin(1920-1957)discoverchemicalstructureofDNA,startinganewbranchofscience--molecularbiology.WatsonandCrickmadeamodeloftheDNAmoleculeandprovedthatgenesdetermineheredity.1957-ArthurKornberg(1918-)oftheU.S.producedDNAinatesttube.1966-TheGene

2、ticcodewasdiscovered;scientistsarenowabletopredictcharacteristicsbystudyingDNA.Thisleadstogeneticengineering,geneticcounseling.1972-PaulBerg(1926-)oftheU.S.producedthefirstrecombinantDNAmolecule.基因组DNA的基本结构与化学组成1核苷酸=1磷酸+1五碳糖+1碱基核酸分两类DNA:碱基A,G,C,TRNA:碱基A,G,C,U双螺旋结构：是由2条平行的多核苷酸围绕同

3、一中心轴构成的。多核苷酸的方向是由核苷酸的磷酸二酯键的走向决定，一条从5’→3’，另一条从3’→5’，两条链呈反向平行排列，彼此由氢键相连，G与C配对，A与T配对。Enpromoter5’△E1GTAGⅠ1▽▽▽▽↓5’UT3’3’UT人类结构基因包括4个区域：编码区：包括外显子、内含子前导区：编码区上游尾部区：编码区下游调控区：包括启动子、增强子等基因的结构E2I2转录起始点终止密码↑AATAAA↓转录终止点↓1ggggacagccagggacaggcagacatgcagccagggctccagggcctggacaggggctgc61caggccct

4、gtgacaggaggaccccgagcccccggcccggggaggggccatggtgctgcct121gtccaacatgtcagccgaggtgcggctgaggcggctccagcagctggtgttggacccggg181cttcctggggctggagcccctgctcgaccttctcctgggcgtccaccaggagctgggcgc241ctccgaactggcccaggacaagtacgtggccgacttcttgcagtgggcggagcccatcgt第一代诊断技术-限制性片段长度多态性检测（RFLP）限制性核酸内切酶:识别

5、和切割特异DNA序列；限制性位点镰性细胞贫血第一代诊断技术-Southern杂交DNA-DNA杂交：Southern杂交基本步骤Deletion第一代诊断技术-DNA体外扩增技术聚合酶链反应（PCR）PCR的特点检材要求低操作简便灵敏度高特异性较好PCR的问题易污染定量困难人为因素影响PCR技术出现的背景1955年发现 DNA polymerase I；70年代的初期发现具有实验价值及可得性Klenow fragment1971年Dr. Kjell Kleppe 提出类似基因修复复制 的PCR原始雏形概念；1976年从热泉的细菌(Thermus A

6、quaticus) 中分离出能耐高温Taq polymerase；1983年Dr. Kary B. Mullis发展出PCR技术，1985年正式发表了第一篇相关的论文。1989 年，PCR被列为年度的重要科学发明产物。PCR反应参数预变性：94℃下预变性5-10min，使模板DNA完全解链。减少非特异性配对的引物与模板复合物形成。循环中的变性：一般变性温度与时间为94℃1min。在变性温度下,双链DNA解链只需几秒钟即可完全,所耗时间主要是为使反应体系完全达到适当的温度。扩增片段GC含量的差异是变性温度选定的主要依据，GC含量高则应相应提高变性温度，反

7、之亦然，但一般不应低于90℃。应注意变性温度过高或时间过长都会导致酶活性的损失。循环中的复性（退火）：PCR的一个关键参数，在理想状态下，退火温度足够低，以保证引物同目的序列有效退火，同时还要足够高，以减少非特异性结合。如何解决这个矛盾？合理的退火温度从55℃到70℃。退火温度一般设定比引物的Tm[4X（C+G）+2X（A+T）或软件计算]低5℃,当产物中出现影响实验的非可异性扩增带时,以2℃为增量，逐步提高退火温度。较高的退火温度会减少引物二聚体和非特异性产物的形成。退火温度越高,所得产物的特异性越高。当多重PCR扩增各引物对Tm值出现差异时，如何初

8、步确定退火温度？一是将退火温度设定为比最低的Tm低5℃；二是根据较高Tm设计的退火温度先进行5