基于基因芯片的人参作用脑组织抗衰老基因表达谱的研究

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1、基于基因芯片的人参作用脑组织抗衰老基因表达谱的研究叶芳苑伟政(西北工业大学徽／纳米系统实验室．西安710072)【摘要】针对D．半乳糖造成的小鼠亚急性衰老模型．采用Cy3和CY5两种不同的荧光染料通过逆转录反应将人参作用前后的小鼠脑组织细胞mRNA分别标记成两种探针，混合后与小鼠基因芯片杂交。借助计算机分析扫描芯片荧光信号图像。寻找出经人参作用后表达有差异的基因．据此研究人参水煎剂对衰老模型小鼠脑组织细胞基因表达的影响．以深入探讨其作用的分子机制．研究表明，徼矩阵基因芯片在研究人参作用前后衰老模型小

2、鼠脑细胞基因表达的改变时，具有快速、高通量、高敏度等特点，为运用生物芯片技术研究中药抗衰老机理提供了有价值的方法。【关键词】基因表达谱：中药人参：亚急性衰老模型：O引言．目前，我国60岁以上老年人口已超过1．26亿人．占总人口的10％。这意味着我国已经进入人口老龄化国家的行列111．随着科学技术的发展和生活水平的提高，人们对延缓衰老的药物及保健食品的需求日益增加．衰老引起的问题日益受到关注0中医药对衰老有独特的认识．中药抗衰老是中医中药的优势所在‘甜．基因表达谱芯片作为用于基因功能研究的新技术已被广

3、泛应用1341，该技术能高效、快速且多参量同时研究大量基因在不同刺激条件下表达的差异。进而阐明相关基因的功能．本文应用基因表达谱芯片来检测人参水煎剂对驴半乳糖所致小鼠亚急性衰老模型脑细胞基因表达的影响．试图进一步探讨人参抗衰老的分子机制。以从基因水平来分析和理解中药的抗衰老机理·1基因表达谱原理基因表达谱(Geneexpressionprofile)是通过构建处于某一特定状态下的细胞或组织的非偏性cDNA文库。收集cDNA序列片段。定性、定量分析其mRNA群体组成，描绘该特定细胞或组织在特定状态下的

4、基因表达种类和丰度信息，从mRNA水平反映了细胞或组织特异性表型和表达模式I’1。表达谱基因芯片其基本构件¨叫依然是由DNA或寡核苷酸组成的芯片(Chip)或微阵列(Microarray)。反应原理也依然是核酸杂交，所不同的是样品标记和检测系统．通过双色荧光标记。即对不同细胞或组织来源的mRNA在逆转录反应中分别用不周颜色的荧光标记成探针，探针混合后与芯片或微阵列板上的基因进行严格杂交、洗涤，用特有的荧光波长扫描芯片；将扫描所得每一点荧光信号值自动输入计算机并进行信息处理，给出每个点在不同波长下的荧

5、光强度值及其比值(Ratio值)，同时计算机还给出直观的显色图．这些信号就代表了样品中基因的转录表达情况⋯’．目前常用的荧光染料是Cy3(绿色)和Cy5(红色)．如果用Cy3dUDP标记组织lmRNA，Cy5dUDP标记组织2mRNA，反应后那些在组织2中呈高表达(或只在组织2中表达)的基因其杂交点就会显红色，相反，那些在组织l中高表达(或只在组织1中表达)的基因其杂交点就会显绿色．在两组织中表达水平相当的显黄色，而均不表达的则为无色．基因表达谱芯片作为目前应用最广泛的基因芯片是将几千个特异性基因的

6、探针或其cDNA固定在一个芯片上，对生物体在生命活动、病理状态以及用药反应等情况下基因表达的变化进行检测。通过用药前后不同细胞或组织内基因表达水平的监测。可揭示药物作用通路上的基因及其调控网络，从而解析药物作用机制“"．2实验设计与方法2812I试剂卜半乳糖稀释成125％储存液．4℃保存；DEPC稀释至01％储存液．4"C保存。2水】I

7、f剂的制备人参切片后浸泡l小时，文火煎三次．沸后半小时过滤．三次药渡混台后浓缩至母毫升古生药量为008g，4℃保存．3实验动物健康3月龄的昆明种雌性小鼠zO只。平均

8、体重2l-559。4方法4l动物分组将实验小鼠随机分成模型给药组和模型对照组．每组10只．分缱群养．自由饮水、摄食。模型对照组和模型给药组按无菌操作每天颈背部皮下注射125％D一半乳糖02ml／只在皮下注射D一半乳糖的同时，模型给药组灌服05m1人参永翦剂(所用药量相当于4曲g原生药／只)．模型对照缎灌服辞体积生理盐水，作为空白对照。连续绘药和遣模6周．于虽后1天灌胃和注射D一半乳糖2小时后，拉头处死．井立即取出脑组织．分离出小脑．生理盐水漂洗后即刻用冷冻保存管转入渡氰中保存备用。4．2芯片制备采用

9、BiostarM一20s芯片．用通用引物进行PcR扩增．P研产物长度为1000～3000bp．PCR反应及产物纯化用标准方法“1进千亍．迥过琼脂糖凝腔电泳监控PCR质量．靶基因{l莩解于3×SSC溶液中．用Cartesian7500点样仪进行硅垸化点样．晾干备用。43总Il}l^的抽提甩改进的一步法⋯’分别抽提模型组及对照组细胞总RNA。方法如下：将超低温保存的样品转移至用液氮预冷的碾钵中，彻底碾碎成粉末状：加入TRlzol试剂，在组织匀浆耢碎帆上进行匀浆；匀浆演离心