枯草芽孢杆菌xf1菌株中xfsaca基因的克隆及功能验证

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1、第33卷第2期华南农业大学学报VoL33．No．22012年4月JournalofSouthChinaAgriculturalUniversityApr．2012枯草芽孢杆菌XF1菌株中XFsacA基因的克隆及功能验证贾凡H，毛自朝H，王志远，赵静，吴毅歆，何月秋，(1云南农业大学农学与生物技术学院，云南昆明650201：2云南农业大学农业生物多样性应用技术国家工程中心，云南昆明650201)摘要：枯草芽孢杆菌BacillussubtilisXF1是从土壤中分离的一株利用蔗糖快、能高效防治根肿病的专

2、利菌株．为探明其高效的蔗糖代谢机制，用PCR从该菌中扩增到蔗糖代谢关键基因蔗糖一6一磷酸水解酶基因(XFsacA基因)，其编码的蛋白质氨基酸序列与枯草芽孢杆菌B168菌株中的XFsacA基因有97％的相似性，且发生了l2个氨基酸突变．将该基因中约1．4kb的编码框序列连接到表达载体pQE30上，构建了重组表达质粒pQE30一XFsacA，该质粒转入到不能利用蔗糖的EscherichiacoliBI21中，后者能在以蔗糖为唯一碳源的M9无机离子培养基中正常生长，并表达出了一条约54000蛋白条带．结果

3、预示XFsaeA基因氨基酸序列的替代可能是XF1高效利用蔗糖的基础，同时XFsacA基因的克隆与其在E．coli中的表达研究，为利用蔗糖发酵的工程E．coli构建奠定了基础．关键词：枯草芽孢杆菌XF1；蔗糖；代谢；基因克隆中图分类号：Q78文献标志码：A文章编号：1001—411X(2012)02—0154—05CloningandFunctionalConfirmationofXFsacAGenefromBacillussubtilisXF1JIAFan”MAOZi—chaoHWANGZhi—yu

4、an，ZHAOJing，WUYi．xin，HEYue—qiu，，，(1FacuhyofAgronomyandBiotechnology，YunnanAgriculturalUniversity，Kunming650201，China；2NationalEngineeringCenterofAgriculturalBiodiversityforAppliedTechnology，YunnanAgriculturalUniversity，Kunming650201，China)Abstract：Baci

5、llussubtilisXF1，whichispatentedandaveryeficientbiocontrolagenttocontrolclubrootdiseaseofcruciferouscrops，growsveryquicklywhensucroseisusedascarbonsource．Toelucidatethegrowthpromotionmechanismofsucrose，theXFsacAgene，encodingakeyenzymeforsucrosemetabo·li

6、sm，wasamplifiedbyPCRandsequenced．Itsaminoacidsequencehas97％homologtoBacillussubti—lisB168except12aminoacidsreplacement．ThecodingregionofthegenewasinsertedintoplasmidpQE30toconstructanexpressionplasmid，pQE30一XFsacA．AfterpQE30-XFsacAwastransformedintoEsc

7、herichiacoliBL21，whichcouldnotusesucrose，aproteinbandabout54000detectedbySDSPAGEanalysisindicatedthegenewassuccessfullyexpressedinBL21．ThefunctionofXFsacAgenewascon-firmedbythetransformedBL21havingtheabilitytogrowandsurviveinM9mediumwithsucroseassoleca

8、rbonsource．Thedataindicatedthatthereplacementof12aminoacidsofXFsacAinXF1strainmightireprovetheefficiencyinuseofsucrose，andcloningandfunctionalexpressionofXFsacAinE．colicouldbeagoodstrategyfordevelopingmetabolicengineeredE．colistraintous